奶牛鏈球菌型乳腺炎乳腺組織基因表達(dá)與microRNA分析及miR--122對(duì)EPO和JAK--STAT通路靶向調(diào)控.pdf

1、奶牛乳腺炎是奶牛最常見的高發(fā)疾病，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，長(zhǎng)期困擾世界奶牛業(yè)發(fā)展。奶牛乳腺炎主要由病原菌侵入乳腺組織而造成乳腺內(nèi)的感染，鏈球菌即是其中主要的致病菌之一。鏈球菌屬革蘭氏陽(yáng)性菌，呈球形或卵圓形，多數(shù)呈鏈狀或成對(duì)生長(zhǎng)。無(wú)乳鏈球菌在奶牛乳腺的感染率可達(dá)11％-43％,感染后奶牛乳腺的自愈率較低。盡管抗生素是目前治療乳腺炎的有效手段，但無(wú)乳鏈球菌對(duì)青霉素G、阿莫西林、氨芐青霉素等的耐藥率已達(dá)50％-100％。解決這一問題需要深入研究病

2、原菌的致病機(jī)理和機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)制，為尋找新的防控乳腺炎的方法提供理論基礎(chǔ)。
　　microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，miRNA可調(diào)控超過60％的編碼蛋白基因，涉及細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡及免疫調(diào)控等生命活動(dòng)過程。利用miRNA表達(dá)的特異性，尋找乳腺組織在炎癥免疫應(yīng)答過程中差異表達(dá)的miRNAs，有助于從分子水平上了解機(jī)體免疫應(yīng)答的機(jī)理，為防控乳腺炎提供新的思路。本研究通過人工誘導(dǎo)方式建立奶牛無(wú)乳鏈

3、球菌型乳腺炎模型，采用Affymetrix牛全基因組芯片技術(shù)獲得鏈球菌型乳腺炎乳腺組織的差異表達(dá)基因，篩選與免疫相關(guān)的通路。同時(shí)采用Solexa高通量深度測(cè)序技術(shù)構(gòu)建兩組小RNA文庫(kù)，分析鏈球菌組差異表達(dá)的miRNAs，對(duì)miRNAs的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析。綜合分析結(jié)果，確定進(jìn)一步研究miR-122是否通過靶向EPO而調(diào)控JAK-STAT通路。將miR-122在乳腺上皮細(xì)胞過表達(dá)和抑制表達(dá)后，采用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)其對(duì)靶基

4、因EPO及其JAK-STAT通路的相關(guān)基因EPOR、JAK2、STAT5A、STAT5B、Bcl-2表達(dá)的影響，再用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miR-122對(duì)EPO3'UTR的靶向調(diào)控作用。本研究得到的結(jié)果如下:
　　(1)奶牛鏈球菌型乳腺炎模型的建立
　　鏈球菌人工誘24h后，試驗(yàn)乳區(qū)出現(xiàn)明顯的乳腺炎臨床癥狀:紅腫、發(fā)熱，觸痛，產(chǎn)奶量減少，奶中有絮狀物，SCC急劇上升，超過200萬(wàn)個(gè)/mL。石蠟組織切片顯示病理變化:乳腺組

5、織結(jié)構(gòu)松散，乳腺間質(zhì)發(fā)生水腫，細(xì)胞間連接空隙增大，乳腺上皮細(xì)胞萎縮，腺泡腔變大，乳腺腔內(nèi)可見脫落的乳腺上皮細(xì)胞、多形核中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等聚集。結(jié)合臨床癥狀表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果確定構(gòu)建奶牛鏈球菌型乳腺炎成功。
　　(2)奶牛鏈球菌型乳腺炎乳腺組織基因表達(dá)特征
　　Affymetrix基因芯片結(jié)果顯示共有差異表達(dá)顯著基因136個(gè)，包括78個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和58個(gè)表達(dá)下調(diào)基因。在這些基因中，18個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因CD34,SD

6、C4,CDH5、APLNR，HTR2B、ACTN2、CACNA1A、CD55、DCP1A、ELMO1、GALNTL4、GAN01、HTR2B、LOC514818、NOTCH2、VWF、PROS1、ITGB4和11個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因EPO、CYPEF3、ABCA12CCL17、LIPG、JAG1、RPS15、TAF4B、C4BPB、XRCC3、FST富集到38條通路，其中與免疫相關(guān)的通路有13條，如JAK-STAT、細(xì)胞因子與因子受體作用、

7、造血細(xì)胞譜系通路、Notch信號(hào)通路等。
　　(3)奶牛鏈球菌型乳腺炎組織的miRNA表達(dá)譜分析
　　miRNA表達(dá)譜分析顯示，鏈球菌組和對(duì)照組分別得到18，535，913和20，847，000條干凈序列。鏈球菌組共有373個(gè)的已知和399個(gè)新的m1RNA，對(duì)照組有358個(gè)已知和232個(gè)新的miRNA。差異表達(dá)顯著的miRNA共35個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)miRNA10個(gè)(miR-122、miR-223、miR-16a、miR-22

8、84k、miR-2484、miR-451、miR-383、miR-486、miR-2332、miR-326),表達(dá)下調(diào)miRNA25個(gè)(miR-378b、miR-145、miR-136、miR-26a、miR-33a、miR-335、miR-3660、miR-146a和miR-206等)。35個(gè)差異表達(dá)miRNAs共預(yù)測(cè)到18，801個(gè)靶基因，靶基因位點(diǎn)數(shù)82，832。GO分析表明預(yù)測(cè)靶基因的分子功能涉及生物過程的主要富集在刺激應(yīng)答、信

9、號(hào)、生物調(diào)節(jié)過程、細(xì)胞死亡、免疫過程上;涉及分子功能的主要富集在結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)上。KEGG分析顯示其主要富集于與免疫相關(guān)的通路如RIG-樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞質(zhì)DNA感受通路、Notch信號(hào)通路等。
　　(4)miR-122靶向EPO3'UTR的驗(yàn)證
　　EPO為miR-122的預(yù)測(cè)靶基因，利用pmiR-RB-REPORTTMVector成功構(gòu)建出EPO3'UTR野生型載體和突變型載體，與miR-122mimic共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

10、，利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)miR-122與EPO3'UTR存在作用靶位點(diǎn)(ACACTCC)，表明miR-122靶向調(diào)控EPO的表達(dá)。
　　(5)奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染條件確定
　　純化的奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞，聚集成島嶼狀生長(zhǎng)，具有典型的鋪路石和鵝卵石形狀，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”形，符合一般細(xì)胞生長(zhǎng)的規(guī)律。實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)到乳腺上皮細(xì)胞成功表達(dá)β酪蛋白mRNA，表明此方法獲得的乳腺上皮細(xì)胞可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

11、經(jīng)不同轉(zhuǎn)染濃度與轉(zhuǎn)染試劑用量的組合試驗(yàn)，最終確定細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件為轉(zhuǎn)染濃度100nM，轉(zhuǎn)染試劑1μL(96孔板)。
　　(6)miR-122過表達(dá)和抑制表達(dá)對(duì)EPO及JAK-STAT通路基因表達(dá)影響
　　將miR-122mimic轉(zhuǎn)染入奶牛乳腺上皮細(xì)胞48h后，miR-122表達(dá)量顯著升高，顯著降低EPO表達(dá)量，JAK-STAT通路基因中EPOR、JAK2、STAT5A、STAT5B和Bcl-2的表達(dá)量均下調(diào)，且Bcl-2下調(diào)顯