超薄羊膜載體的制備及其在構(gòu)建組織工程角膜上皮中的應(yīng)用.pdf

1、目的:羊膜是目前應(yīng)用最廣泛的構(gòu)建組織工程角膜上皮的載體。但在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，基于羊膜構(gòu)建的組織工程角膜上皮在移植術(shù)后角膜的透明度恢復(fù)并不理想。目前認(rèn)為，羊膜基質(zhì)的纖維細(xì)胞層及疏松的海綿層可能是影響羊膜透明度的主要原因。因此，本研究對傳統(tǒng)去上皮羊膜（DAM）進(jìn)行改造，制備一種新型的超薄羊膜(UAM)載體，并評估其生物學(xué)及光學(xué)性質(zhì)，同時探討使用該種載體構(gòu)建組織工程角膜上皮的可行性。
　　方法:本研究利用0.02％的EDTA去除失活羊膜

2、組織的上皮細(xì)胞，并采用Ⅳ型膠原酶消化去除羊膜基質(zhì)的纖維層及海綿層，從而獲得羊膜致密層。比較從不同位置來源的胎兒面及胎盤面羊膜，選擇合適的羊膜來源。以傳統(tǒng)的完整羊膜(IAM)及DAM為對照組，探討UAM的物理及生物學(xué)特性，包括光學(xué)透明度、組織結(jié)構(gòu)、脫細(xì)胞程度、超微結(jié)構(gòu)，并通過對Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅶ型膠原、Lamnin5及Perlacan進(jìn)行免疫熒光及組化染色分析UAM的生物成分。在此基礎(chǔ)上，采用UAM作為載體構(gòu)建組織工程角膜上皮，并觀察角

3、膜上皮片的超微結(jié)構(gòu)，利用western blot、RT-PCR以及免疫熒光染色分析細(xì)胞表型(K3、K14、K12、p63、ABCG2)、細(xì)胞連接(Connexin43、Claudin-1、β-Catenin、Occludin、E-cadherin)及抗新生血管(TIMP-1、thrombospondin-1)相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)情況。最后，采用該組織工程角膜上皮移植治療模型動物的全角膜緣干細(xì)胞缺乏。術(shù)后觀察移植細(xì)胞的存活、眼表的上皮化、炎癥

4、以及角膜新生血管形成情況等，并觀察移植術(shù)后2周角膜上皮的組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞表型變化。
　　結(jié)果:UAM是一種透明、脫細(xì)胞、膠原纖維排列致密的材料，厚度約20-30μm左右，主要含有Ⅰ型和Ⅲ型膠原及部分基底膜Laminin5成分?；赨AM構(gòu)建的角膜上皮片較傳統(tǒng)的DAM載體構(gòu)建的角膜上皮片厚度更厚且透明度更佳。同時，在UAM上培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞與其底層的羊膜載體貼附緊密，且表達(dá)更多的p63、ABCG2、β-catenin、TIMP-1、

5、thrombospondin-1等角膜上皮祖細(xì)胞、緊密連接及抗新生血管相關(guān)的標(biāo)記物。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)移植術(shù)后2周，基于UAM構(gòu)建的組織工程角膜上皮可成功治療全角膜緣干細(xì)胞缺乏動物模型。移植術(shù)后2周發(fā)現(xiàn)，UAM移植組較DAM移植組角膜上皮細(xì)胞復(fù)層化及透明度更好。
　　結(jié)論:基于UAM構(gòu)建的組織工程角膜上皮透明度較好，同時在其表面擴(kuò)增的角膜緣干細(xì)胞能夠維持角膜緣組織的正常細(xì)胞表型，移植術(shù)后效果也更佳。UAM保留了完整的羊膜致密層結(jié)構(gòu)