組織工程人角膜上皮的體外重建、鑒定及其在新西蘭兔角膜上皮移植中的作用研究.pdf

1、中國(guó)海洋大學(xué)博士學(xué)位論文組織工程人角膜上皮的體外重建、鑒定及其在新西蘭兔角膜上皮移植中的作用研究姓名：徐彬申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：樊廷俊20120602啐『國(guó)海洋夫?qū)W稿壬硼萌盛蔦％跳文一的生長(zhǎng)因子和蛋白酶抑制因子以及抗炎癥、抗成纖維化、抗菌、抗血管生成等的相關(guān)蛋白，與HCEPC具有理想的生物相容性并能促進(jìn)HCEPC的細(xì)胞分化，己被廣泛應(yīng)用于眼表重建，因此被認(rèn)為是TEHCEP的理想載體支架之一。本文在本實(shí)驗(yàn)室自主建立的

2、非轉(zhuǎn)染HCEPC細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，對(duì)此細(xì)胞系的屬性和致瘤性進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，首次以該細(xì)胞為種子細(xì)胞建、以去上皮層羊膜(denudedAM，dAM)為載體支架，開(kāi)展TEHCEP的體外重建研究，并利用LSCD新西蘭兔模型對(duì)TEHCEP在角膜上皮移植中的作用進(jìn)行鑒定，旨在建立TEHCEP體外重建的技術(shù)工藝條件，獲得可長(zhǎng)期維持兔角膜透明的TEHCEP，為T(mén)EHCEP替代捐獻(xiàn)角膜用于角膜上皮異常疾病的臨床治療創(chuàng)造條件。為了進(jìn)一步鑒定非轉(zhuǎn)染HCEPC細(xì)

3、胞系的屬性、功能蛋白的表達(dá)及潛在致瘤性，本文對(duì)第80代HCEPC進(jìn)行了復(fù)蘇、擴(kuò)增培養(yǎng)和鑒定。屬性檢測(cè)結(jié)果顯示，復(fù)蘇的第80代HCEPC透明度高，形態(tài)飽滿，呈圓形或卵圓形，鑲嵌排列呈鋪路狀，細(xì)胞群體倍增時(shí)間為4075h，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，分裂旺盛，特征性染色體數(shù)目仍為2n=46。功能蛋白的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，該細(xì)胞能夠表達(dá)HCEP特異性標(biāo)志蛋白——角蛋白(keratin)3和12，以及緊密連接蛋白ZO1、E鈣粘蛋白、間隙連接蛋白43、整聯(lián)蛋白B

4、1，表明該細(xì)胞仍具有角膜上皮的表型，且具有形成完整HCEP結(jié)構(gòu)的潛能。致瘤性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，該細(xì)胞無(wú)致瘤性。因此，該細(xì)胞為T(mén)EHCEP體外重建提供了種子細(xì)胞。為了獲得TEHCEP體外重建的理想載體支架，本文以新鮮AM為材料，采用胰酶倒置消化法對(duì)其進(jìn)行去上皮層處理，再使用Ⅳ型膠原進(jìn)行包被，并通過(guò)接種HCEPC研究dAM的生物相容性。通過(guò)光鏡、電鏡以及石蠟切片HE染色等方法對(duì)處理后的AM以及HCEPC在經(jīng)包被的dAM上的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了觀察和鑒

5、定，結(jié)果顯示利用胰酶于37℃倒置消4_520min，再經(jīng)Ⅳ型膠原包被后獲得的dAM表面平整，無(wú)上皮細(xì)胞殘留，且有基底膜結(jié)構(gòu)；dAM對(duì)HCEPC具有理想的生物相容性，且光學(xué)性能良好。因此，dAM能夠作為理想的載體支架進(jìn)行TEHCEP的體外重建研究。為了建立TEHCEP體外規(guī)?；亟ǖ募夹g(shù)工藝條件，本文以生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HCEPC為種子細(xì)胞，以dAM為載體支架，采用氣液界面培養(yǎng)法體外重建TEHCEP。利用石蠟切片HE染色、免疫組織化學(xué)檢測(cè)及電