硫酸頭孢喹肟陽(yáng)離子前體脂質(zhì)體的制備、表征及其體外抗金黃色葡萄球菌生物膜的研究.pdf

1、硫酸頭孢喹肟為第四代動(dòng)物用頭孢類抗生素，因其對(duì)絕大部分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有較強(qiáng)的殺滅效果而常用于治療由金黃色葡萄球菌等細(xì)菌引起的家畜呼吸道疾病以及乳房炎疾病等。有研究表明，金黃色葡萄球菌較易形成生物膜，這也是該細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的原因之一。所以尋找抗金黃色葡萄球菌生物膜的新型有效制劑對(duì)該菌的防控有著至關(guān)重要的意義。
　　本研究旨在構(gòu)建硫酸頭孢喹肟陽(yáng)離子前體脂質(zhì)體并探討其對(duì)細(xì)菌生物膜的作用，以獲得對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好作用的

2、硫酸頭孢喹肟新制劑。通過(guò)優(yōu)化硫酸頭孢喹肟陽(yáng)離子前體脂質(zhì)體的制備工藝，并對(duì)其相關(guān)性質(zhì)、體外釋放以及抗金黃色葡萄球菌生物膜的效果進(jìn)行考察，達(dá)到了預(yù)期研究目的。主要研究結(jié)果如下:
　　1.建立了專屬性較強(qiáng)的反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定硫酸頭孢喹肟的體外含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=51313C-22439，R2=0.9997，藥物濃度在1.25～160μg/ml之間與峰面積有較好的線性關(guān)系，回收率99.30％～101.60％，日

3、間和日內(nèi)精密度均小于5％，該方法可用于藥物含量測(cè)定并排除雜質(zhì)和輔料的干擾。同時(shí)，對(duì)脂質(zhì)體破乳劑及低溫高速離心法分離脂質(zhì)體與游離藥物的效果進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，加入適量的四氫呋喃可以充分破壞脂質(zhì)體的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu);將脂質(zhì)體溶液4℃，15000 r/min，離心1h可以將游離藥物與脂質(zhì)體良好分離，且游離藥物的回收率達(dá)到99.72％～101.17％，為后期制劑工藝的設(shè)計(jì)和優(yōu)化打下基礎(chǔ)。
　　2.采用固體分散法結(jié)合泡騰水化法制備硫酸頭孢

4、喹肟陽(yáng)離子前體脂質(zhì)體，以包封率為主要考察指標(biāo)并結(jié)合制劑外觀形態(tài)，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)以及正交實(shí)驗(yàn)對(duì)硫酸頭孢喹肟陽(yáng)離子前體脂質(zhì)體的制備方法進(jìn)行篩選，得到最佳處方工藝為:減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為54℃，CC14的用量為20 ml，Tween80用量為75μl，大豆卵磷脂與膽固醇的用量比為2∶1，藥物與大豆卵磷脂和膽固醇的用量比為1∶10，檸檬酸與NaHCO3的用量比為5∶1，藥物與十八胺的用量比為1∶5。此工藝下得到的脂質(zhì)體平均包封率為63.21％，載

5、藥量為4.04％。
　　3.按最佳工藝處方制備得到的硫酸頭孢喹肟陽(yáng)離子前體脂質(zhì)體分散后為白色均勻混懸液，其平均粒徑為201.5 nm，Zeta電位為65.29 mV。體外累積釋放實(shí)驗(yàn)顯示，8h時(shí)，原料藥的累計(jì)釋放量達(dá)到了藥物總量的97.82％，陽(yáng)離子脂質(zhì)體僅達(dá)到了藥物總量的73.94％，這證明本試驗(yàn)制備得到的陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有一定的緩釋性。溶血性試驗(yàn)和刺激性試驗(yàn)結(jié)果表明所制備脂質(zhì)體無(wú)明顯溶血效果和血管刺激性。藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)證明硫酸頭

6、孢喹肟陽(yáng)離子前體脂質(zhì)體在高濕度和強(qiáng)光照射下不穩(wěn)定，應(yīng)干燥避光保存。
　　4.采用二倍稀釋法考察硫酸頭孢喹肟溶液、硫酸頭孢喹肟普通脂質(zhì)體及其陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌及10株豬源性臨床分離菌的最小抑菌濃度(MIC值)。結(jié)果顯示，三種制劑對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌的MIC值依次分別為1、1.34、0.48μg/ml，三種制劑對(duì)臨床菌的MIC值均有不同程度的上升，說(shuō)明臨床菌有一定的耐藥性，硫酸頭孢喹肟陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)部分臨床菌的MIC

7、值小于溶液。通過(guò)分光光度計(jì)法檢測(cè)了硫酸頭孢喹肟溶液及其陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的抑制作用，結(jié)果顯示，在加入藥物2h后，細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線開(kāi)始出現(xiàn)差距;而同樣為0.5MIC藥物濃度，陽(yáng)離子脂質(zhì)體抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的效果更明顯。藥物濃度≥MIC值時(shí)，藥物作用后的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)很快進(jìn)入衰亡期，藥物濃度越高，進(jìn)入衰亡期的時(shí)間越快，甚至跳過(guò)了細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期。
　　5.運(yùn)用剛果紅、結(jié)晶紫、硝酸銀等方法共同鑒定了金黃色葡萄球菌標(biāo)

8、準(zhǔn)菌及10株豬源性臨床菌生物膜的形成能力。MTT法測(cè)定了藥物對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的清除率及藥物作用時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的清除效果。結(jié)果顯示，11株金黃色葡萄球菌均能形成穩(wěn)定的生物膜結(jié)構(gòu)，其中4株細(xì)菌形成細(xì)菌生物膜的能力較強(qiáng)。同樣為MIC藥物濃度條件下，陽(yáng)離子脂質(zhì)體在24 h對(duì)細(xì)菌生物膜的清除效果更明顯。而2.5MIC值時(shí)，其對(duì)生物膜的清除率已經(jīng)達(dá)到了81.30％。同時(shí)藥物濃度與細(xì)菌生物膜的清除率呈正相關(guān)，且藥物對(duì)細(xì)菌生物膜的清除

9、能力表現(xiàn)出了時(shí)間依賴性。環(huán)境掃描電鏡圖像結(jié)果表明，本試驗(yàn)所制得脂質(zhì)體與生物膜接觸后，其中的細(xì)菌數(shù)量及生物膜基質(zhì)的量均有所降低，這些結(jié)果均證實(shí)陽(yáng)離子脂質(zhì)體制劑在抗金黃色葡萄球菌生物膜方面有一定優(yōu)勢(shì)。
　　本課題研究結(jié)果表明，采用固體分散法結(jié)合泡騰水化法制備得到的硫酸頭孢喹肟陽(yáng)離子前體脂質(zhì)體方法簡(jiǎn)便，質(zhì)量可控，重現(xiàn)性好，包封率、載藥量、粒徑等指標(biāo)均符合脂質(zhì)體制劑要求。該制劑能夠減緩體外金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)速度，同時(shí)對(duì)該菌所形成的生物膜