黃單胞菌屬DNA條形碼篩選及其重要致病變種檢測技術研究.pdf

1、黃單胞菌屬是最為重要的植物病原細菌屬之一，能夠危害多種重要的糧食及經(jīng)濟作物，其中有14種為我國檢疫性有害生物。由于屬內(nèi)成員數(shù)目眾多，種下又分為許多致病變種，致使該屬種及種下階元的鑒定存在很大困難。DNA條形碼技術是一種利用特定的DNA序列來鑒定物種的分子生物學技術，具有準確、快速、高通量等優(yōu)點，可以很好地滿足口岸檢疫及植保機構的工作需求。因此，為了提高在種及種下階元上準確鑒定黃單胞菌的能力，本研究開展了黃單胞菌屬DNA條形碼技術研究，同

2、時為了提高該屬內(nèi)一些重要致病變種的精準鑒定能力，我們還針對其開展了數(shù)字PCR檢測方法研究。
　　(1)黃單胞菌屬DNA條形碼基因篩選以327株不同種或致病變種的黃單胞菌為實驗材料，基于進化樹法及遺傳距離法等分別對16S rRNA基因，cpn60，avrBs2，hrp，hpaA，gyrB和rpoD這7個候選條形碼基因進行了篩選驗證及有效性評價。研究結果表明cpn60基因的PCR擴增與測序成功率都要明顯優(yōu)于其他候選基因。基于其構建的系

3、統(tǒng)發(fā)育樹也顯示該基因?qū)S單胞菌屬種及種下階元的區(qū)分鑒定能力最為理想。同時在barcoding gap分析和best close match測試中該基因也都表現(xiàn)的最為出色，其種/致病變種間遺傳距離明顯大于種/致病變種內(nèi)遺傳距離，而且對不同種/致病變種的鑒定正確率達到了99％以上，是理想的用于區(qū)分鑒定黃單胞菌的條形碼基因。
　　(2)黃單胞菌屬DNA條形碼檢測體系的建立及應用基于篩選出的DNA條形碼基因及研究獲得的大量序列數(shù)據(jù)，建立了

4、黃單胞菌屬DNA條形碼檢測技術體系。同時利用該體系和多種傳統(tǒng)鑒定方法對收集到的疑似黃單胞菌分離物及病害樣品進行了應用驗證與比較分析，結果顯示多種檢測方法得到的結果均保持一致，但相比之下，DNA條形碼檢測方法的鑒定結果準確度更高，操作過程也更為簡便快速，易于推廣。
　　(3)黃單胞菌屬重要致病變種檢測技術研究以水稻細菌性條斑病菌、水稻白葉枯病菌以及它們的近緣菌為研究對象，分別基于細菌性條斑病菌的假定膜蛋白基因和白葉枯病菌的rhs家族

5、基因建立了這兩種病原菌的特異性數(shù)字PCR檢測體系。對方法的特異性、靈敏度及重復性進行了測試，并用模擬帶菌水稻種子及真實種子樣品進行了檢測驗證。結果表明，所建立的兩種方法均能特異性的檢測出目標菌株，且均具有較高的靈敏度及良好的重復性，在模擬帶菌種子及自然帶菌種子樣品的應用驗證中也都得到了滿意的結果。
　　總之，本研究為黃單胞菌屬種及種下階元的準確鑒定提供了新的可靠的分子識別方法，對提高該屬有害生物的鑒定能力，保護國內(nèi)農(nóng)業(yè)和生態(tài)安全具