甲基丙烯酸酯類高性能基因載體的構(gòu)建、制備與表征.pdf

1、隨著人類社會的發(fā)展，遺傳性疾病、癌癥以及心血管疾病等重大疾病的發(fā)病率逐年上升，嚴重威脅人類的健康，傳統(tǒng)的醫(yī)療手段很難徹底治愈這些疾病，基因治療利用將外源正?；?qū)氚屑毎姆绞綖檫@些疾病開辟了新的治療手段。目前，制約基因治療的關(guān)鍵是缺乏既安全又高效的基因載體，由于病毒載體的安全性較差，人們的研究重心轉(zhuǎn)向了非病毒基因載體的研制，而目前研究最廣泛的非病毒基因載體是陽離子聚合物。原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)是一種活性可控的聚合方法，其反應溫

2、度適中、適用單體種類多，非常適用于制備多功能的陽離子聚合物。本論文根據(jù)目前非病毒基因載體材料的發(fā)展趨勢，針對載體轉(zhuǎn)染效率低且毒性高的科學問題，在ATRP法的基礎(chǔ)上制備了一系列高性能的甲基丙烯酸酯類陽離子基因載體，通過細胞實驗和動物實驗評價了載體的基因轉(zhuǎn)染效率，對促進安全高效的非病毒基因載體的研制具有重要意義。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、乓掖及?EA)功能化的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)衍生物基因載體(PGEA)由于含有豐富的

3、仲胺和羥基基團，在不同的細胞系中，具有較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的細胞毒性。我們利用低分子量的PGEA對苝-3，4，9，10-四羧酸二酰亞胺(PBI)進行修飾，制備出一種帶有熒光成像功能的雙功能陽離子基因載體(PBI-PGEA)。這種載體材料在不同的細胞系中均能表現(xiàn)出較高的基因轉(zhuǎn)染效率。此外，PBI-PGEA能夠在2-5分鐘內(nèi)快速有效地完成對細胞的染色，并且在染色過程中不會產(chǎn)生明顯的細胞毒性，避免了對細胞可能產(chǎn)生的副反應。
　?、聘鶕?jù)相

4、關(guān)報道，生物還原性的引入會提高基因載體的轉(zhuǎn)染效率。本論文中，我們利用天然多糖Pullulan的肝細胞特異性以及具有生物還原性的雙硫鍵，通過ATRP法成功地制備了具有良好生物相容性的可剪切的肝靶向性梳狀陽離子基因載體，首先在普魯蘭的羥基上引入含有可生物還原雙硫鍵的ATRP引發(fā)位點，隨后通過ATRP反應引入PGMA側(cè)鏈，最后通過醇胺(EA)功能化合成以普魯蘭多糖為骨架，可生物還原的肝靶向性梳狀陽離子基因載體PuPGEA。該載體材料不僅具有優(yōu)

5、于陽離子基因載體的國際金標PEI的基因轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性，而且通過在不同細胞內(nèi)吞抑制劑存在的情況下進行基因轉(zhuǎn)染測試，發(fā)現(xiàn)PuPGEA系列載體材料具有肝細胞靶向性，通過溶血性測試，發(fā)現(xiàn)PuPGEA系列載體材料具有極好的血液相容性。
　?、窃谥苽淞司哂休^高轉(zhuǎn)染效率和較低細胞毒性載體的基礎(chǔ)上，我們又制備出了一種既能夠傳遞基因又能夠運送抗癌藥物的雙功能基因載體。首先利用簡單的兩步法在氧化石墨烯表面引入含有雙硫鍵的ATRP引發(fā)位點，隨后在其

6、表面可控地引發(fā)甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)聚合，制備一系列有機-無機雜化產(chǎn)物(SS-GPD)，通過X射線光電子能譜(XPS)和原子力顯微鏡(AFM)表征氧化石墨烯以及SS-GPD納米顆粒。與純的氧化石墨烯片層和PDMAEMA均聚物相比，SS-GPD系列載體材料表現(xiàn)出更好的DNA縮合能力，更低的細胞毒性以及更高的轉(zhuǎn)染效率。此外，氧化石墨烯片層可與帶芳香環(huán)的抗癌藥物10-羥基喜樹堿(CPT)形成共軛結(jié)構(gòu)，通過對細胞進行活性測試，發(fā)

7、現(xiàn)SS-GPD系列材料可以很好地將藥物運送到細胞內(nèi)，因此其可被作為潛在的藥物載體。
　　⑷心血管疾病是一直以來都是人類健康的頭號殺手，居各種死亡原因首位，盡管有如他汀類藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑以及β-受體阻滯藥等治療性藥物，心血管疾病的發(fā)病率一直持續(xù)增長，因此需要開發(fā)新型的治療手段。最近，有研究結(jié)果表明miR-29b的過表達可以減輕慢性腎臟疾病的纖維化、肺臟纖維化及心臟纖維化。我們之前的研究表明，EA功能化的聚甲基丙烯酸縮水甘

8、油酯(PGEA)具有大量的仲胺基團，使其具有良好的基因傳遞效率，同時，由于其側(cè)鏈上含有大量的羥基，使得材料的毒性較低，并且，特殊形狀（如星型或梳狀）陽離子聚合物與同等分子量的線性聚合物相比，具有更低的細胞毒性和更高的轉(zhuǎn)染效率，在此基礎(chǔ)之上，我們利用BIBB修飾的季戊四醇(PER)作為引發(fā)劑，與GMA進行ATRP聚合，合成星狀聚合物star-like PGMA(s-PGMA)，并通過后續(xù)的EA功能化，合成以PER為核心的星型陽離子聚合物基