功能化納米材料的電化學(xué)免疫傳感及其對金黃色葡萄球菌檢測研究.pdf

1、本論文針對現(xiàn)有食品安全快速檢測領(lǐng)域中關(guān)于食源性致病菌檢測的技術(shù)需求，結(jié)合納米技術(shù)、材料科學(xué)、傳感技術(shù)等領(lǐng)域的最新研究成果，探索用于食品中食源性致病菌快速檢測的生物傳感新方法。實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌為研究對象，在充分分析與總結(jié)現(xiàn)有金黃色葡萄球菌檢測方法的基礎(chǔ)上，利用新型功能化納米材料構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)食品樣品中金黃色葡萄球菌的快速、高靈敏檢測。研究工作中還利用層層自組裝等方法設(shè)計(jì)了多種致病菌抗體在電極表面的固定化方法，提高了免疫反應(yīng)

2、效率與電化學(xué)免疫傳感器的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了快速、高靈敏和寬線性范圍的電化學(xué)免疫分析。本論文主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下：
　　1.基于自組裝金納米棒的免標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感的構(gòu)建及其對金黃色葡萄球菌檢測
　　構(gòu)建了一種基于自組裝金納米棒的電化學(xué)免疫傳感器并用于高靈敏檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法。首先，在處理過的玻碳電極(GCE)表面利用正負(fù)電荷相互作用逐層組裝聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)，聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)以及金納米棒(G

3、NR)，從而構(gòu)建了功能化的GCE/PDDA/PSS/GNR傳感界面。緊接著將能夠特異性識別金黃色葡萄球菌表面抗原的抗體蛋白(Ab)通過與金納米棒之間的特異性吸附作用功能化到上述電極表面，從而成功構(gòu)建免標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感界面GCE/PDDA/PSS/GNR/Ab，并實(shí)現(xiàn)樣品溶液中金黃色葡萄球菌的快速檢測。在檢測過程中，當(dāng)金黃色葡萄球菌被抗體捕獲后，阻礙了電極表面的電子轉(zhuǎn)移，使得電子轉(zhuǎn)移電阻增加，表現(xiàn)為電子轉(zhuǎn)移電阻與金黃色葡萄球菌的濃度成正

4、比。實(shí)驗(yàn)過程中對一些影響傳感器性能的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明在抗體濃度100μg mL-1，免疫溫度37℃，免疫時間50 min的條件下，所制備的傳感器的檢測性能最佳。該電化學(xué)免疫傳感器對金黃色葡萄球菌線的性檢測范圍為1.8×103-1.8×107 CFU mL-1，線性相關(guān)系數(shù)為0.993，最低檢測限為100 CFU mL-1。同時，該免疫傳感器對非目標(biāo)菌如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、短小芽孢桿菌、肺炎克雷伯菌以及枯草芽孢桿菌無明顯檢測

5、信號，表現(xiàn)出良好的特異性。在實(shí)際樣品牛奶檢測中，免疫傳感器的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.0％-6.8%之間，表明該免疫傳感器具有良好的準(zhǔn)確性。
　　2.金屬離子功能化聚苯乙烯-丙烯酸納米球用于高靈敏電化學(xué)檢測食品中金黃色葡萄球菌
　　建立了一種基于銅離子功能化的聚苯乙烯-丙烯酸納米球的電化學(xué)免疫傳感器并用于高靈敏檢測牛奶中金黃色葡萄球菌的方法。實(shí)驗(yàn)中首先合成了形貌均一、性質(zhì)穩(wěn)定的聚苯乙烯-丙烯酸納米球(PSA)，并依次利用聚烯丙基胺鹽

6、酸(PAH）、聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)功能化PSA納米球，接著通過靜電吸附作用將大量的Cu2+組裝到PSA納米球表面，即PSA/PAH/(PSS/Cu2+)n。隨后通過戊二醛交聯(lián)金黃色葡萄球菌抗體(Ab)到上述納米球表面，從而成功構(gòu)建PSA/PAH/(PSS/Cu2+)n/Ab這一多功能電化學(xué)納米探針。實(shí)驗(yàn)中，在金電極表面首先組裝一層11-巰基十一烷酸(MUA)，并通過N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥

7、基琥珀酰亞胺(NHS)將能夠識別金黃色葡萄球菌抗原的抗體。實(shí)驗(yàn)中通過電極表面的抗體捕獲樣品中一定濃度的金黃色葡萄球菌，然后將該納米探針識別到金黃色葡萄球菌表面，從而得到類似三明治結(jié)構(gòu)的免疫反應(yīng)物。最后將通過免疫反應(yīng)結(jié)合到電極表面的PSA/PAH/(PSS/Cu2+)n/Ab探針中的Cu2+洗脫釋放出來進(jìn)行電化學(xué)溶出伏安檢測。實(shí)驗(yàn)過程中對一些影響傳感器性能的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明在(PSS-Cu)n層數(shù)為3層、免疫反應(yīng)時間為40 min

8、的條件下，所制備的傳感器其檢測性能最佳。該電化學(xué)免疫傳感器對金黃色葡萄球菌線性檢測范圍為3.2×102-3.2×107 CFU mL-1，線性相關(guān)系數(shù)為0.995，最低檢測限為70 CFU mL-1。該電化學(xué)免疫傳感器對菌副溶血弧菌、'枯草芽孢桿菌以及大腸桿菌無明顯檢測信號，表現(xiàn)出良好的特異性。在實(shí)際樣品牛奶的檢測中，多次數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.4%-6.7%之間，回收率在96.1%-100.7%之間，表明該免疫傳感器具有良好

9、的準(zhǔn)確性，并可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測。
　　3.基于快速磁分離電化學(xué)免疫傳感的金黃色葡萄球菌高靈敏檢測
　　建立了一種基于快速磁分離技術(shù)的電化學(xué)免疫傳感器及對食品中金黃色葡萄球菌實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測的方法。實(shí)驗(yàn)中首先分別合成了抗體功能化的量子點(diǎn)(QDs-Ab)以及抗體功能化的納米磁珠(Fe3O4-Ab)，二者同時特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌，形成三明治結(jié)構(gòu)的免疫反應(yīng)復(fù)合物。在試管底部外加磁場，此免疫反應(yīng)復(fù)合物在磁場作用下于底部富集，并與

10、反應(yīng)液自動分離。除去上清液及多次洗滌，目標(biāo)物可實(shí)現(xiàn)徹底分離，加入稀HNO3溶液超聲釋放出CdTe量子點(diǎn)中的Cd2+，隨著金黃色葡萄球菌濃度的增加，檢測液中溶解的Cd2+的量也就越大，電流信號值也就越大。實(shí)驗(yàn)過程中對一些影響傳感器性能的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明在免疫時間40 min，免疫溫度為37℃的條件下，所制備的傳感器的檢測性能最佳。該電化學(xué)免疫傳感器對金黃色葡萄球菌的線性檢測范圍為2.2×102-2.2×107 CFU mL-1，線