基于碳基納米材料-魯米諾的電致化學發(fā)光生物酶傳感新方法研究.pdf

1、本論文首先綜述電致化學發(fā)光的基本原理、常見的反應類型及常用的發(fā)光試劑和納米材料參與電化學發(fā)光構建生物傳感的現(xiàn)狀。石墨烯量子點作為一種新型電化學發(fā)光試劑，在構建生物傳感方面也表現(xiàn)出良好的特性?；贓CL-RET技術已應用于DNA、細胞傳感及免疫分析等領域。基于此，本論文以電化學發(fā)光方法構建生物傳感為目標，利用納米材料信號增強作用，構建新型電化學發(fā)光生物傳感器分別用于DNA甲基轉移酶和蛋白激酶的檢測，進一步開展了DNA甲基轉移酶和蛋白激酶對

2、應抑制劑的篩選等相關研究，主要包括以下兩個方面的工作：
　　1.成功合成了具有電化學發(fā)光特性的GO/AgNPs/luminol復合物用于構建新型Dam MTase活性檢測的ECL傳感器。首先，在氧化石墨烯表面以luminol為還原劑還原硝酸銀（AgNO3）為 AgNPs，成功制備了具有電化學發(fā)光特性的GO/AgNPs/luminol復合物，接著加入炔丙胺后通過 Ag-N鍵形成炔基功能化的GO/AgNPs/luminol復合物，在C

3、u(I)催化下炔基化合物與疊氮化合物發(fā)生點擊反應將 GO/AgNPs/luminol復合物組裝在疊氮修飾 dsDNA的電極表面，在共反應劑H2O2存在時產生luminol的強電致化學發(fā)光（ECL）；將該電極浸入DNA甲基轉移酶（Dam）溶液中，含5′-GATC-3′序列的dsDNA發(fā)生甲基化，而后被甲基化限制性內切酶Dpn I剪切，使得部分GO/AgNPs/luminol復合物從電極表面脫落下來，導致 luminol的ECL信號下降。G

4、O/AgNPs/luminol的ECL減少與Dam濃度呈正相關。因此，可通過ECL信號的變化檢測Dam的活性，對Dam檢測的線性范圍為0.1-20 U/mL，檢測限為0.03 U/mL。本方法還可用于Dam抑制劑的篩選，從5-氟尿嘧啶對應的ECL響應曲線計算得到IC50值為18.2μM。
　　2.以石墨烯量子點（GQDs）和魯米諾（luminol）分別為陰極和陽極ECL發(fā)光試劑，建立了雙電位比率ECL傳感平臺，用于檢測蛋白激酶活性

5、及抑制劑篩選。首先，將羧基化的GQDs通過共價鍵合作用組裝在殼聚糖修飾電極表面，通過酰胺作用使多肽連接在電極表面，在巰基三磷酸腺苷（ATP-s）和蛋白激酶（PKA）的作用下，多肽發(fā)生磷酸化，進而通過Au-S鍵作用將Au NPs捕獲于巰基磷酸化多肽修飾電極表面。以H2O2為共反應劑時，GQDs和靠近電極表面的Au NPs發(fā)生能量共振轉移使GQDs的陰極ECL強度下降，同時，該Au NPs促進了luminol在電極表面的電子傳遞而使得lum

6、inol的陽極ECL強度上升。在同一體系中，同時實現(xiàn)了GQDs的陰極ECL減小和luminol的陽極ECL增強。隨著激酶濃度的增加，更多的Au NPs被捕獲于電極上，使得對luminol的ECL反應有更高的電催化活性，同時與GQDs有更強的ECL能量共振轉移。因此，luminol的ECL增加程度與GQDs的ECL減小程度的比值與PKA活性呈正相關，對PKA檢測的線性范圍為0.01-10 U/mL，檢測限為0.005U/mL。本方法還可用