茶樹橙花叔醇合成酶基因的催化功能、時(shí)空表達(dá)及其調(diào)控機(jī)理.pdf

1、香氣是評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，茶葉各類揮發(fā)性香氣物質(zhì)中萜類物質(zhì)對(duì)成品茶的香氣品質(zhì)有很大影響。最近的研究表明，植物揮發(fā)性萜類物質(zhì)合成酶基因的表達(dá)受茉莉酸及其下游的MYC2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。本研究旨在探明茶樹中參與主要倍半萜香氣物質(zhì)生物合成的萜類合成酶基因的功能及這些基因的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)與調(diào)控技術(shù)，以增進(jìn)茶葉香氣品質(zhì)和茶樹抗逆性。
　　倍半萜中的橙花叔醇具有宜人的香味，它以糖苷態(tài)儲(chǔ)藏在茶樹葉片中是茶葉香氣形成的前體物質(zhì)，其含量的高低決

2、定了茶葉香氣的香型和品質(zhì)。倍半萜是植物逆境誘導(dǎo)的揮發(fā)性物質(zhì)的重要組成成分，它們有多種植物生理學(xué)和生態(tài)學(xué)功能，例如防御功能、抗逆性、植物間的信號(hào)傳遞。因此，研究茶樹中的倍半萜變得尤為重要。利用從本實(shí)驗(yàn)室前期獲得茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到的法尼烯焦磷酸合成酶基因、橙花叔醇合成酶基因和轉(zhuǎn)錄因子MYC2基因的序列片段，以茶農(nóng)抗早[Camellia sinensis(L.) O.Kuntze cv.Nongkangzao]鮮葉為試材，通過RACE技術(shù)，

3、成功克隆了茶樹法尼烯焦磷酸合成酶基因CsFPS、橙花叔醇合成酶基因CsNES和轉(zhuǎn)錄因子CsMYC2的全長。CsNES基因全長1659 bp，編碼含552個(gè)氨基酸、分子量為63.5 KDa、等電點(diǎn)為5.46；CsFPS基因全長1029bp，編碼342個(gè)氨基酸、分子量為39.5 KDa、等電點(diǎn)為5.67。
　　對(duì)CsNES進(jìn)行在線BLASTX比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該酶具有萜類合成酶的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)“DDxxD”和萜類合成酶的活性位點(diǎn)“EDxxD

4、”。構(gòu)建該基因原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)獲得重組蛋白。利用GC-MS對(duì)重組蛋白的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)該蛋白以法尼烯焦磷酸（FPP）為底物時(shí)催化生成橙花叔醇和法尼烯，以香葉基焦磷酸（GPP）為底物時(shí)催化生成少量的芳樟醇。CsNES的C端與eGFP融合后，在洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該基因產(chǎn)物定位在細(xì)胞質(zhì)中。此外，對(duì)CsNES的表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)逆境信號(hào)物質(zhì)茉莉酸甲酯能顯著增強(qiáng)橙花叔醇合成酶基因的表達(dá)，通過染色體步移技術(shù)獲得CsN

5、ES的啟動(dòng)子742bp，利用在線啟動(dòng)子分析軟件PLACE分析啟動(dòng)子序列，分別在-214和-688處發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子MYC2的結(jié)合位點(diǎn)E-BOX，說明CsNES受轉(zhuǎn)錄因子MYC2調(diào)節(jié)，參與茉莉酸信號(hào)途徑。表明該基因可能參與茶樹抗逆反應(yīng)。
　　利用植物雙元表達(dá)載體pBI121，將CsNES、CsFPS、CsMYC2基因在煙草中進(jìn)行過表達(dá)，已經(jīng)獲得成功獲得陽性轉(zhuǎn)基因植物。
　　為了研究茶樹倍半萜類物質(zhì)的生物合成和調(diào)控機(jī)理，本研究