脂肪酶高產(chǎn)菌的選育、酶的純化和表征以及兩種誘導(dǎo)方式產(chǎn)酶的機(jī)理研究.pdf

1、脂肪酶是一種既可催化水解反應(yīng)又可催化合成反應(yīng)的生物催化劑。因微生物脂肪酶的產(chǎn)量高，便于基因操作，生產(chǎn)無(wú)季節(jié)波動(dòng)等原因，比植物和動(dòng)物來(lái)源的脂肪酶的應(yīng)用更為廣泛。本研究依靠羅丹明B橄欖油初篩培養(yǎng)基從5份土樣中篩選到16株細(xì)菌和16株真菌。通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液酶活和專一性，對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)篩，并利用SHERLOCK(R)全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)、26～28S rDNA或ITS序列測(cè)定等方法進(jìn)行鑒定。復(fù)篩出7株產(chǎn)酶較優(yōu)菌，其中Pseudomonas sp.B

2、1-1、Acinetobacter sp.B1-2、Acinetobacter sp.B5-1、Trichosporon sp.F1-2為sn-1(3)位專一性，Staphylococcus sp.B2-1、Acinetobacter sp.B3-8和Galactomyces candidumF1-1無(wú)專一性。所有分離菌中T.sp.F1-2的酶活力最高，因此選為重點(diǎn)研究對(duì)象。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其與T.cacaoliposimilis和T.

3、laibachii的進(jìn)化關(guān)系最近。
　　研究發(fā)現(xiàn)，T.sp.F1-2的胞外比酶活高于胞內(nèi)，所以更有利于純化。通過(guò)50％飽和度的硫酸銨沉淀、8000～14000Da透析和DEAE-sepharose FF弱陰離子交換柱層析(pH8.3)的純化步驟，將T.sp F1-2脂肪酶純化了3.96倍，比酶活達(dá)到223.13 U/mg，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析，測(cè)得其分子量為32.6kDa。本論文詳細(xì)研究了T.sp F1-2脂肪酶的性質(zhì)。該酶能

4、長(zhǎng)期耐受的最高溫度為45℃，短期最適反應(yīng)溫度為50℃，其最適保藏pH范圍為7.0～9.0，最適反應(yīng)pH為8.0。該酶具有sn-1(3)位專一性。其對(duì)底物的鏈長(zhǎng)也具有明顯的選擇性，最優(yōu)的底物是辛酸酯;該酶在Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Mn2+等金屬離子中酶活穩(wěn)定性較好，Zn2+是其最強(qiáng)的酶活抑制劑。該酶對(duì)各種類型的表面活性劑都很敏感，但對(duì)非離子型表面活性劑的耐受性稍好于陰離子表面活性劑。該酶對(duì)多種有機(jī)溶劑都表現(xiàn)出非常突出的耐受性，乙

5、醚、二氯甲烷、甲苯和正己烷還能一定程度上提升其酶活，其對(duì)強(qiáng)極性試劑丙三醇、二甲基亞砜和甲醇的高耐受性在脂肪酶中較少見。
　　深入研究了兩種誘導(dǎo)方式，即外加誘導(dǎo)油和自身合成油脂分別為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物。當(dāng)添加誘導(dǎo)油發(fā)酵時(shí)，菌體會(huì)轉(zhuǎn)運(yùn)誘導(dǎo)油到胞內(nèi)，形成球狀的脂質(zhì)體，并且在轉(zhuǎn)運(yùn)前先將誘導(dǎo)油乳化成極小的油滴，以便于轉(zhuǎn)運(yùn)。低濃度葡萄糖發(fā)酵時(shí)，由于第一碳源很快耗盡，轉(zhuǎn)運(yùn)在發(fā)酵24h時(shí)已經(jīng)很顯著。高濃度葡萄糖發(fā)酵時(shí)，雖然并不缺乏葡萄糖，也會(huì)在稍晚于低濃

6、度發(fā)酵一段時(shí)間后開始快速轉(zhuǎn)運(yùn)油脂，形成大量脂質(zhì)體，這很可能便是高糖發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酶仍維持高水平的原因。經(jīng)過(guò)脂肪酸組成分析確認(rèn)，誘導(dǎo)油發(fā)酵時(shí)，胞內(nèi)脂質(zhì)體的脂肪酸組成與誘導(dǎo)油一致，確系來(lái)自胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，這與葡萄糖的初始濃度無(wú)關(guān)。當(dāng)不添加誘導(dǎo)油發(fā)酵時(shí)，該菌仍會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)化葡萄糖形成較多的脂質(zhì)體。由于合成脂類需要脂肪酶參與，且合成后積累在體內(nèi)又成了自產(chǎn)的誘導(dǎo)油，進(jìn)一步促進(jìn)脂肪酶的生成，因此，即使不添加誘導(dǎo)油，該菌也能生產(chǎn)一定量的脂肪酶。該菌自產(chǎn)的脂類主要含五

7、種脂肪酸:肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸。降低發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源濃度，有利于油脂積累，且會(huì)影響脂肪酸的組成，使得飽和脂肪酸的含量增加，不飽和脂肪酸的含量減少。對(duì)比兩種誘導(dǎo)途徑，直接添加誘導(dǎo)油發(fā)酵產(chǎn)酶的效率要高于自身產(chǎn)油誘導(dǎo)的效率，且采用前種發(fā)酵時(shí)，從種子培養(yǎng)就開始添加誘導(dǎo)油會(huì)顯著提高產(chǎn)酶量，而對(duì)于后種發(fā)酵，種子培養(yǎng)基中添加油并不會(huì)提高胞外產(chǎn)酶。
　　生產(chǎn)能力偏低是限制T.sp F1-2實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的主要原因。于是利用常壓

8、室溫等離子體對(duì)野生菌進(jìn)行了誘變處理，并建立了96孔板培養(yǎng)結(jié)合對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯法測(cè)定酶活力的高通量篩選方法，實(shí)現(xiàn)了60個(gè)突變菌株的初篩。以酶活力為篩選指標(biāo)時(shí)，突變率和正突變率分別為51.7％和28.3％。8株初篩菌株的搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，A13和A5的產(chǎn)酶提高最顯著，培養(yǎng)96h后分別比野生菌增加2.64倍和1.54倍，且兩個(gè)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性良好。進(jìn)一步的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，突變菌株A13相較野生菌的最大優(yōu)勢(shì)在于提前24 h便能達(dá)到最高產(chǎn)酶量

9、。
　　本論文還利用商業(yè)化酶制劑研究了脂肪酶的兩種重要特性，位置專一性和?；w移。脂肪酶的位置專一性在結(jié)構(gòu)酯的合成和油脂改性中具有重要意義。由于水體系和非水體系的差異，傳統(tǒng)的水解判定法得出的專一性與該酶在合成反應(yīng)中的表現(xiàn)可能并不一致。于是建立了利用月桂酸和山茶油的酸解反應(yīng)來(lái)直接評(píng)估酶在無(wú)溶劑體系中位置專一性的方法。利用此方法，Lipozyme RM IM、L02、L03和L04被鑒定為sn-1(3)位專一性，L01為弱專一性，No

10、vozym435近似無(wú)專一性。通過(guò)替換酶的底物，模型反應(yīng)的可預(yù)測(cè)性得到驗(yàn)證。根據(jù)酸解法和水解法結(jié)果的對(duì)比分析，兩種條件下酶的位置專一性通常是相同的，除了易受到溶劑體系影響的Novozym435。因此，新方法能夠避免水解判定結(jié)果在合成反應(yīng)中應(yīng)用的局限性。
　　除了酸解反應(yīng)模型，還建立了一個(gè)酯交換反應(yīng)模型來(lái)研究酰基遷移的影響因素。模型反應(yīng)的底物為等摩爾量的三月桂酸甘油酯和1，3-棕櫚酸-2-油酸甘油酯，三種固定化脂肪酶參與了此反應(yīng)。通

11、過(guò)測(cè)定甘油三酯的組成和脂肪酸的分布來(lái)檢測(cè)sn-1(3)位的酯交換和sn-2位的酰基遷移。固定化于聚丙烯的Rhizopus oryzae脂肪酶表現(xiàn)出非常嚴(yán)格的sn-1(3)位專一性，2位發(fā)生的改變非常小。而固定化于二氧化硅的Thermomyces lanuginosus脂肪酶(Lipozyme(R)TL IM)能在24h內(nèi)完成完全的隨機(jī)化。固定化于聚丙烯的T.lanuginosus脂肪酶能催化2位發(fā)生中等程度的改變。因此，T.lanugi