河蜆多糖結(jié)構(gòu)特征、生物活性及其對(duì)人體腸道菌群的影響.pdf

1、河蜆(Corbicula fluminea)是雙殼類軟體動(dòng)物，又稱黃蜆，在我國(guó)的東部沿海地區(qū)多有分布。本草綱目記載河蜆作為中藥的藥材，具有開(kāi)胃、通乳、明目、利尿、去濕毒、治療肝病、麻疹、退熱、止咳化痰、解酒等功效。目前對(duì)河蜆功能成份的研究主要集中在蛋白和脂類物質(zhì)方面，對(duì)多糖的研究還較少，而且不夠深入。本論文對(duì)河蜆多糖進(jìn)行系統(tǒng)的研究，包括提取條件優(yōu)化、分離純化、結(jié)構(gòu)特性、抗氧化活性、抗腫瘤活性以及對(duì)人體腸道菌群微生態(tài)的影響等方面。主要結(jié)果

2、如下:
　　1、河蜆多糖超聲輔助酶法提取條件的優(yōu)化
　　選擇提取溫度、提取時(shí)間、液料比及超聲強(qiáng)度4個(gè)因素分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定了各因素在RSM實(shí)驗(yàn)中的取值中心點(diǎn)。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用doehlert matrix(DM)設(shè)計(jì)對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、液料比及超聲強(qiáng)度4個(gè)參數(shù)的實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行優(yōu)化。運(yùn)用Matlab軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，得出最優(yōu)提取條件為提取溫度60℃、提取時(shí)間30min、液料比35ml/g、超聲強(qiáng)度300

3、W。在此條件下，河蜆得率值為35.4％。
　　2、河蜆多糖的分離純化及理化性質(zhì)
　　運(yùn)用陰離子交換柱和凝膠層析柱對(duì)河蜆粗多糖進(jìn)行分離純化，得到CFPS-1和CFPS-2。采用HPSEC對(duì)CFPS-1和CFPS-2的純度和分子量作近一步鑒定，其相對(duì)分子質(zhì)量分別是283和22kDa。運(yùn)用化學(xué)、物理的方法分別對(duì)粗CFPS、CFPS-N、CFPS-1和CFPS-2的化學(xué)特征進(jìn)行分析。其中CFPS-1的蛋白含量(10.8％)、糖醛酸含

4、量(14.34％)相對(duì)較高，而CFPS-2的總糖含量(94.4％)及硫酸基含量(8.1％)相對(duì)較高。單糖分析表明粗CFPS、CFPS-N、CFPS-1主要由葡萄糖組成，而CFPS-2主要由葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、氨基半乳糖、氨基葡萄糖組成，各單糖比例分別是0.7∶0.3∶0.9∶0.2∶0.2。
　　3、河蜆多糖的結(jié)構(gòu)解析
　　運(yùn)用原子力顯微鏡(AFM)對(duì)河蜆多糖進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)CFPS-N分子相互盤繞呈球形。CFPS-1和C

5、FPS-2中可以看到單獨(dú)游離于溶液中的糖鏈，糖鏈直徑是在10-20nm之間，長(zhǎng)度為1500-2000nm之間。結(jié)合多糖甲基化、GC-MS及核磁共振技術(shù)分析的結(jié)果，推測(cè)出CFPS-1及CFPS-2可能的結(jié)構(gòu)。
　　4、河蜆多糖的抗氧化、抗腫瘤活性
　　體外抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，與河蜆粗糖(CFPS和CFPS-N)相比，純化產(chǎn)物CFPS-1和CFPS-2有較強(qiáng)的抗氧化活性。體外抗腫瘤活性篩選結(jié)果表明，CFPS-1對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(M

6、DA-MB-231)的抗增殖效果最為顯著。末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNNEL)顯示隨著CFPS-1濃度的增加可以很好的誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。因此，我們近一步采用蛋白質(zhì)印記技術(shù)研究細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明其機(jī)制很可能是通過(guò)對(duì)ASK1蛋白的活化，進(jìn)一步激活p38/p53途徑。p53蛋白的增加一方面抑制Cyclin D1、CDK4和PCNA蛋白的表達(dá)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制癌癥細(xì)胞過(guò)度增殖。同時(shí)，還可以使線粒體中C

7、aspase-3酶原裂解成為活性蛋白Caspase-3酶，最終激活凋亡特異性核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　5、河蜆多糖對(duì)人體腸道菌群微生態(tài)的影響
　　我們發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有微生物參與的情況下，胃-腸道消化液對(duì)河蜆多糖CFPS-N的降解作用很有限。近一步研究腸道菌群與CFPS-N的代謝關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，CFPS-N能夠被腸道微生物所降解，并且發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物中乙酸、丙酸和丁酸的含量較高。DGGE的結(jié)果發(fā)現(xiàn)代謝多糖后的菌群結(jié)構(gòu)主要由厚壁菌