變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸代謝調(diào)控蛋白PtxS的克隆表達(dá)、分離純化及鑒定.pdf

1、2-酮基葡萄糖酸（2-ketogluconic acid,2KGA）是一種重要的有機(jī)酸，也是生產(chǎn)食品抗氧化劑異抗壞血酸的前體物質(zhì)。本論文旨在從國(guó)內(nèi)2KGA生產(chǎn)的主要工業(yè)用菌——變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）JUIM01中克隆發(fā)酵目的產(chǎn)物代謝調(diào)控蛋白PtxS的基因，并對(duì)該基因進(jìn)行表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)分析、基因敲除、聚丙烯酰氨凝膠電泳、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

2、、圓二色光譜儀、動(dòng)態(tài)光散射以及等溫滴定量熱等技術(shù)，對(duì)PtxS蛋白的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行初步的研究，進(jìn)而為后續(xù)的2KGA高效生產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供一定的理論依據(jù)。
　　主要研究結(jié)果如下：
　?。?）采用TD-PCR技術(shù)首次從變形假單胞菌JUIM01中克隆了ptxS基因，其核苷酸序列全長(zhǎng)為1023 bp，編碼由340個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白PtxS。生物信息學(xué)的分析結(jié)果表明：變形假單胞菌JUIM01的PtxS蛋白與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Ps. p

3、utida、Ps. mosselii和Ps. plecoglossicida的PtxS蛋白在氨基酸序列上具有較高的一致性，分別達(dá)到88％、84%和74%；該P(yáng)txS蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于氨基酸序列的N末端，包含螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序；該P(yáng)txS蛋白的理論分子質(zhì)量為36651.7 u，理論等電點(diǎn)為6.39；該P(yáng)txS蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)，為親水性蛋白；該P(yáng)txS蛋白中有7個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)、3個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)蛋

4、白激酶C磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)LacI-type HTH結(jié)構(gòu)域；該P(yáng)txS蛋白中存在α螺旋（alpha helix）、延伸鏈（extended strand）、β轉(zhuǎn)角（beta turn）和無(wú)規(guī)卷曲（random coil）4種結(jié)構(gòu)形式，各自所占的比例分別為54.41%、13.53%、10.88%和21.18%；該P(yáng)txS蛋白與參與2KGA分解代謝的一些蛋白質(zhì)具有臨近關(guān)系，且同時(shí)存在于細(xì)胞中。
　?。?）通過(guò)對(duì)克隆的ptxS基因以及質(zhì)粒

5、pET-28a進(jìn)行雙酶切、連接等操作，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-ptxS，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了重組菌株E. coli BL21(DE3)/pET-28a-ptxS。聚丙烯酰氨凝膠電泳分析結(jié)果表明，ptxS基因在E. coli BL21(DE3)中得到了成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量為36.7 ku，與采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的PtxS蛋白的分子質(zhì)量相符。對(duì)重組菌株的菌體細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，然后通過(guò)離心分離、凍融沉淀等方法去除部分雜蛋白，再利用

6、親和層析以及凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行分離純化，得到了純化的PtxS蛋白。圓二色光譜分析結(jié)果表明，PtxS蛋白中α螺旋，延伸鏈，β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲所占比例分別為52.3%、11.5%、14.3%和22.0%，與使用SOPMA工具預(yù)測(cè)的結(jié)果相似。動(dòng)態(tài)光散射分析結(jié)果表明，純化的PtxS蛋白在溶液中以單體形式存在，其粒徑、分子質(zhì)量和多分散指數(shù)（polydispersity, Pd）分別為2.554530 nm、30 ku和23.2%。
　　（3）

7、基于生物信息學(xué)分析結(jié)果，采用重疊PCR（overlap PCR）技術(shù)克隆了ptxS基因的缺失片段，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了ptxS基因的敲除菌株P(guān)s. plecoglossicida JUIM01ΔptxS。通過(guò)比較菌株JUIM01ΔptxS與菌株JUIM01的2KGA發(fā)酵過(guò)程可以發(fā)現(xiàn)，PtxS蛋白可以阻遏2KGA的分解代謝。等溫滴定量熱（isothermal titration calorimetry，ITC）分析結(jié)果表明，在體外2KGA可以

8、特異性地結(jié)合PtxS蛋白；與2KGA的結(jié)合可以導(dǎo)致PtxS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的明顯改變。因此，可以認(rèn)為2KGA是PtxS蛋白的效應(yīng)物分子。從課題組克隆的2KGA利用操縱子即kgu操縱子（2-ketogluconate utilization operon, kgu operon）中，檢索到位于其5'端的14 bp的反向重復(fù)序列（5'-TGAAACCGGTTTCA-3'）。ITC分析結(jié)果表明，純化的PtxS蛋白在體外可以與反向重復(fù)序列（5'-T