甲殼素酶產(chǎn)生菌的篩選及酶法制備甲殼低聚糖的研究.pdf

1、天然存在的甲殼素結(jié)構(gòu)致密、結(jié)晶度高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水、稀堿和稀酸及大部分有機(jī)溶劑，很難被水解。本文旨在利用蒸汽爆破、高壓均質(zhì)、輻照等物理方法處理甲殼素，破壞其結(jié)晶結(jié)構(gòu)；并從自然界篩選甲殼素酶產(chǎn)生菌，利用其甲殼素酶水解甲殼素制備甲殼低聚糖，嘗試解決目前生產(chǎn)甲殼低聚糖過程中污染嚴(yán)重等問題。本論文的主要研究結(jié)果如下：
　　（1）從土壤中分離得到一株產(chǎn)甲殼素酶的細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定，確定為多粘類芽孢桿菌（Paen

2、ibacillus polymyxa)，命名為A1。通過發(fā)酵條件優(yōu)化，確定了菌株A1發(fā)酵產(chǎn)甲殼素酶條件如下：培養(yǎng)基采用1％甲殼素（120目），0.05%MgSO4·7H2O，1.2%尿素，0.5%NaCl，0.07% K2HPO4，0.03%KH2PO4，0.3%酵母提取粉，初始pH4.5，接種齡12 h，接種量1%，于37℃培養(yǎng)78 h，在此條件下，該菌產(chǎn)甲殼素酶水平達(dá)到0.549 U/mL。
　?。?）多粘類芽孢桿菌A1發(fā)酵上

3、清液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、透析、冷凍干燥后制得甲殼素酶粗酶，經(jīng)DEAE-52離子交換柱層析、Sephadex G-75凝膠過濾柱層析分離純化，制得電泳純的甲殼素酶，純化倍數(shù)為4.3，回收率為18.4%。
　?。?）對(duì)上述純化的甲殼素酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，確定其相對(duì)分子質(zhì)量約為30.0 kDa，最適反應(yīng)溫度為50℃，溫度低于45℃時(shí)，酶的熱穩(wěn)定性較好。該酶最適反應(yīng)pH值為4.5，但是在pH4.0-5.0之間穩(wěn)定性較好。SDS、維生素C和H

4、2O2對(duì)該酶有抑制作用，N-乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖和葡萄糖對(duì)該酶有一定的激活作用；Ca2+，F(xiàn)e2+,Fe3+，Ni2+對(duì)該酶有激活作用，Cu2+對(duì)該酶有抑制作用。在以膠體甲殼素為底物的最適條件下，該酶的米氏常數(shù)Km為4.28 mg/mL。該酶可水解羧甲基甲殼素，在水解的最初階段，溶液的粘度迅速下降，表明該酶屬于內(nèi)切酶。
　?。?）比較了蒸汽爆破、高壓均質(zhì)和輻照三種處理方法對(duì)甲殼素結(jié)構(gòu)的破壞效果。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)蒸汽爆破和

5、高壓均質(zhì)處理后的甲殼素的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了許多小孔或凹槽，結(jié)構(gòu)也變得比較疏松，輻照處理后的甲殼素的結(jié)構(gòu)無變化；X射線衍射結(jié)果顯示蒸汽爆破三次處理后的甲殼素的結(jié)晶指數(shù)CrI110和CrI020分別下降了23.2%和24.7%，高壓均質(zhì)三次處理后的甲殼素的結(jié)晶指數(shù)CrI110和CrI020分別下降了12.4%和28.7%，輻照處理后的甲殼素?zé)o變化。這些結(jié)果表明，蒸汽爆破和高壓均質(zhì)預(yù)處理能夠降低甲殼素的結(jié)晶度。通過紅外光譜還發(fā)現(xiàn)經(jīng)蒸汽爆破和高壓均質(zhì)處

6、理后的甲殼素的脫乙酰度有所提高，蒸汽爆破三次和高壓均質(zhì)三次處理后的甲殼素的脫乙酰度由20.3%分別提高到33.5%和26.0%，輻照處理后的甲殼素?zé)o變化。
　?。?）用非專一性酶水解無定型甲殼素發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶水解效果最高，但木瓜蛋白酶對(duì)未處理的甲殼素以及經(jīng)過蒸汽爆破和高壓均質(zhì)處理后的甲殼素均不能水解。灰色鏈霉菌外切甲殼素酶能夠水解未處理的甲殼素、蒸汽爆破處理的甲殼素和高壓均質(zhì)處理的甲殼素，水解液中還原糖濃度分別為0.251 mg/

7、mL、0.145 mg/mL和0.407 mg/mL。用多粘類芽孢桿菌A1甲殼素酶分別水解未處理的甲殼素以及經(jīng)過蒸汽爆破、高壓均質(zhì)和輻照處理的甲殼素，發(fā)現(xiàn)蒸汽爆破三次處理組和高壓均質(zhì)二次處理組的還原糖濃度比對(duì)照組分別提高了40%和300%左右，而輻照處理組與未處理組則沒有差別。說明蒸汽爆破和高壓均質(zhì)預(yù)處理可以提高甲殼素酶對(duì)甲殼素的作用效率。
　?。?）GPC、HPLC和質(zhì)譜分析結(jié)果表明，多粘類芽孢桿菌A1甲殼素酶水解膠體甲殼素的產(chǎn)