Kupffer細(xì)胞在熱射病中的功能變化及丹參酮ⅡA磺酸鈉對其調(diào)控作用研究.pdf

1、研究背景:
　　熱射病(heat stroke，HS)是一種急性熱致疾患，典型表現(xiàn)為核心體溫升高(＞40℃)和神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，按發(fā)病原因不同分為經(jīng)典型熱射病(classical heatstroke，CHS)和勞力型熱射病(exertional heat stroke，EHS)。隨著全球氣候變暖和城市熱島效應(yīng)加劇，夏季極端氣候不斷出現(xiàn)，HS的發(fā)生率和死亡率明顯上升，嚴(yán)重威脅著人民身體健康。其發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明，而HS動物模

2、型的建立對此具有重要意義。傳統(tǒng)的CHS動物模型建立方法是將大鼠置于仿真熱氣候動物艙內(nèi)、模擬高溫高濕環(huán)境促使其發(fā)病。然而仿真熱氣候動物艙設(shè)備價格昂貴、體積龐大，因而限制了其應(yīng)用。而動物體溫維持儀建模時間短、成本低、實驗條件要求相對降低，具有廣泛應(yīng)用的潛在價值，但目前尚無兩種方法對比的研究。
　　對于其發(fā)病機(jī)制，國內(nèi)外學(xué)者提出了熱直接損傷、腸源性內(nèi)毒素血癥、熱調(diào)節(jié)功能障礙、熱應(yīng)激異常等致病學(xué)說。熱應(yīng)激狀態(tài)下的內(nèi)毒素血癥是近年來研究的熱

3、點。該學(xué)說認(rèn)為:當(dāng)體溫升高到一定程度時，腸粘膜對內(nèi)毒素的通透性增大，腸道內(nèi)毒素大量進(jìn)入血液循環(huán)，刺激免疫細(xì)胞，釋放腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-alpha，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)、干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子與內(nèi)毒素共同作用，引發(fā)炎性級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致HS及其并發(fā)癥的發(fā)生。一些研究也發(fā)現(xiàn)，針對內(nèi)

4、毒素或某些細(xì)胞因子的措施可降低HS的發(fā)病率或死亡率。這些理論構(gòu)成了HS內(nèi)毒素學(xué)說的基本骨架，腸源性內(nèi)毒素血癥的形成和炎性反應(yīng)的爆發(fā)在HS的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用，而這兩者都可能與肝臟Kupffer細(xì)胞(Kupffer cells，KCs)關(guān)系密切。
　　KCs是位于肝竇內(nèi)的巨噬細(xì)胞。正常情況下，由腸道吸收入門靜脈的內(nèi)毒素幾乎可被KCs全部清除。有研究發(fā)現(xiàn)肝臟缺血再灌注、阻塞性黃疸、肝纖維化、失血性休克和胰腺炎時KCs的吞噬功

5、能受到抑制，分泌功能亢進(jìn)，致使炎癥反應(yīng)擴(kuò)大，病情加重;抑制KCs的分泌功能則可減輕上述疾病的炎癥反應(yīng)，改善病情。
　　目前，KCs與HS發(fā)生發(fā)展的關(guān)系還不清楚。在HS的致病過程中，既有體溫升高的持續(xù)打擊又有內(nèi)毒素的不斷刺激，KCs處于這種特殊環(huán)境之下，其吞噬和分泌功能發(fā)生了怎樣的變化？這些變化與HS內(nèi)毒素血癥的形成及炎性反應(yīng)的爆發(fā)有何關(guān)聯(lián)？產(chǎn)生這些變化的可能機(jī)制是什么？目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究報道。我們推測KCs可能與HS的發(fā)生發(fā)展

6、存在聯(lián)系。理由如下:1、分析HS時內(nèi)毒素血癥的形成原因，除了與內(nèi)毒素的生成增多有關(guān)外，不能排除KCs吞噬功能減弱的可能。因此，我們推測，HS時KCs的吞噬功能減弱，利于腸源性內(nèi)毒素溢出網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，激活循環(huán)或組織中的的炎性細(xì)胞，形成炎癥瀑布，造成機(jī)體多臟器炎性損害;2、研究已發(fā)現(xiàn)HS患者血漿炎癥因子TNF-α、IL-1β、INF-γ水平是升高的;將體溫降至正常水平并不能抑制這些炎癥因子，KCs具有很強(qiáng)的分泌炎性細(xì)胞因子的能力。因此，我們

7、推測，HS時KCs吞噬內(nèi)毒素能力下降、并分泌過多的炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、INF-γ），推動HS的炎癥反應(yīng)過程。
　　丹參具有多種藥理作用，其有效成分之一丹參酮ⅡA具有改善血液循環(huán)、抗菌和抗炎等作用，由于該成分為脂溶性，難溶于水，臨床上多使用其極易溶于水的磺酸鈉鹽（丹參酮ⅡA磺酸鈉，sodium tanshinoneⅡ A sulfonate，STS）。研究發(fā)現(xiàn)STS可抑制KCs分泌活性，減輕炎癥反應(yīng)造成的肝損傷。據(jù)

8、此我們推測，HS時STS可以調(diào)節(jié)KCs的功能，即改善其吞噬功能、抑制其分泌功能。
　　研究目的:
　　本研究旨在明確:
　　1.應(yīng)用動物體溫維持儀與仿真熱氣候動物艙建立的大鼠CHS模型是否相似;
　　2.HS時KCs的功能是否發(fā)生改變;
　　3.STS干預(yù)能否改善HS時KCs的功能變化。
　　研究方法：
　　一、應(yīng)用動物體溫維持儀與仿真熱氣候艙建立大鼠經(jīng)典型熱射病模型的比較
　　1.SPF

9、級雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為室溫對照(C-C)組、高溫對照(HS-C)組、高溫麻醉(HS-A)組。實驗期間C-C組大鼠置于室溫自由活動。HS-C組大鼠預(yù)設(shè)干球溫度（35±0.5）℃、濕球溫度（27±0.5）℃的仿真熱氣候動物艙內(nèi)進(jìn)行熱暴露。HS-A組大鼠麻醉后置于預(yù)設(shè)溫度為35℃的動物體溫維持儀的電熱毯內(nèi)接受熱暴露。
　　2.監(jiān)測大鼠核心體溫（Tc，以直腸溫度代替）、動脈收縮壓（SBP，以尾動脈收縮壓代替）

10、，直至SBP上升至峰值后開始下降作為大鼠HS發(fā)生的標(biāo)志，記錄大鼠發(fā)病時間及Tc。
　　3.所有大鼠于建模前一天、建模結(jié)束時麻醉后采血，檢測外周血白細(xì)胞(WBC)計數(shù)，ELISA檢測血清CRP、TNF-α、IL-1β濃度。
　　4.建模結(jié)束時將各組大鼠麻醉后開顱、開腹，觀察各組大鼠大腦、肺、肝、小腸、腎等主要臟器大體病變，留取相應(yīng)標(biāo)本行HE染色，觀察病理改變。
　　二、熱射病大鼠模型中Kupffer細(xì)胞功能變化及丹參酮Ⅱ

11、A磺酸鈉對其功能的調(diào)控作用
　　1.SPF級雄性SD大鼠57只，隨機(jī)分為4組:正常對照(NC)組3只;熱射病模型(HS)組、丹參酮ⅡA磺酸鈉干預(yù)(STS)組、生理鹽水干預(yù)(NS)組各18只，三組大鼠按建模結(jié)束/給藥后0h、2h、6h、12h、24h、48h依次隨機(jī)分為6個亞組，每組3只。
　　2.NC組大鼠置于室溫自由活動。HS、STS、NS組大鼠在應(yīng)用動物體溫維持儀、以核心體溫達(dá)到43.5℃為標(biāo)準(zhǔn)建立CHS模型后立即轉(zhuǎn)移至

12、室溫環(huán)境，STS組大鼠按2mg/100g體重經(jīng)股靜脈給予STS，NS組大鼠經(jīng)股靜脈給予等體積生理鹽水，HS組大鼠不予特殊處理。
　　3.在各亞組達(dá)相應(yīng)時間點后分別股靜脈注射印度墨水(0.1 ml/100g)，肝臟組織HE染色計算KCs吞噬指數(shù)及門靜脈、肝靜脈抽血，鱟試劑盒檢測內(nèi)毒素濃度評估KCs吞噬功能;ELISA檢測外周血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ濃度，RT-PCR檢測肝臟組織炎性因子mRNA表達(dá)水平評估KCs分泌功能

13、。
　　統(tǒng)計分析：
　　實驗數(shù)據(jù)使用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)間的多重比較采用LSD-t檢驗;計數(shù)資料以頻數(shù)和率表示，組間比較采用x2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　一、應(yīng)用動物體溫維持儀與仿真熱氣候艙建立大鼠經(jīng)典型熱射病模型的比較
　　1.HS-C組與HS-A組大鼠接受熱暴露之后呼吸、心率

14、加快，皮膚黏膜出現(xiàn)紫紺，唾液腺分泌增加。HS-C組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡。兩組大鼠均可見四肢抽搐現(xiàn)象發(fā)生。實驗結(jié)束時，HS-C組大鼠死亡2只，HS-A組死亡1只。
　　2.HS-A組大鼠發(fā)病時間比HS-C組明顯縮短，發(fā)病時SBP及Tc比HS-C組低(P＜0.01)。
　　3.HS-A組與HS-C組大鼠建模后外周血WBC計數(shù)、CRP、TNF-α、IL-1β等炎癥相關(guān)指標(biāo)明顯升高(P＜0.01)。建模后HS-A組大鼠CRP、TNF

15、-α、IL-1β等炎性因子水平比HS-C組低(P＜0.01)，而兩組大鼠WBC計數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4.建模后HS-A組與HS-C組大鼠主要臟器病理改變無明顯差異。
　　二、熱射病大鼠模型中Kupffer細(xì)胞功能變化及丹參酮ⅡA磺酸鈉對其功能的調(diào)控作用
　　1.HS大鼠KCs吞噬印度墨水及自身腸源性內(nèi)毒素的能力與NC組相比明顯下降(P＜0.01)，NS組大鼠KCs吞噬能力在各個時間點與HS組相比無明顯差異(P＞0.0

16、5)，但STS干預(yù)可顯著提高其吞噬指數(shù)、改善其對內(nèi)毒素的吞噬(P＜0.05)。
　　2.HS大鼠外周血中TNF-α、IL-1β、IFN-γ等炎性因子的水平、肝臟KCs上述炎性因子的mRNA水平較NC組明顯升高(P＜0.01)。NS干預(yù)對HS大鼠炎性因子表達(dá)無明顯影響，而STS干預(yù)可顯著降低外周血炎因子水平、下調(diào)KCs中上述炎性因子mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　1.應(yīng)用動物體溫維持儀建立大鼠CHS