羅格列酮對(duì)OLETF大鼠肝臟組織病理變化及IL-17、Bcl-xl表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　糖尿?。╠iabetes mellitus DM）是一組代謝性疾病，由于胰島素分泌缺陷和/或障礙引起的以慢性高血糖為主的疾病。長(zhǎng)期持續(xù)的高血糖和代謝紊亂，可導(dǎo)致全身組織器官損傷和功能障礙。肝臟在2型糖尿病(T2DM)的致病中有著重要的作用，作為一個(gè)靶器官，肝臟在糖尿病狀態(tài)下也會(huì)受到損害。持續(xù)的高血糖使得晚期糖基化產(chǎn)物增加，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維化增加，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，肝細(xì)胞炎癥增加，細(xì)胞凋亡加劇等一系列變化。<

2、br>　　本實(shí)驗(yàn)以與OLETF大鼠其同系的LETO鼠作為對(duì)照組，OLETF大鼠以及經(jīng)羅格列酮治療大鼠均為實(shí)驗(yàn)組，觀察各組大鼠肝臟組織的病理改變。并測(cè)定肝臟細(xì)胞炎癥因子IL-17以及凋亡因子Bcl-xl的表達(dá)變化。進(jìn)一步來探討羅格列酮對(duì)2型糖尿病OLETF大鼠肝臟組織的影響。
　　方法:
　　大鼠單籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，12/12h循環(huán)光照。LETO為正常組12只，給予普通飼料喂養(yǎng)，僅注射緩沖溶液。飼養(yǎng)一個(gè)月后，每?jī)芍茏鲆淮翁?/p>

3、耐量實(shí)驗(yàn)，大鼠禁食16h后灌胃給予單劑的糖(25％葡萄糖溶液1mL/100g)2.5g/kg作為進(jìn)食，在給藥前及給藥后30、60、120min分別從尾靜脈取血，以血糖儀測(cè)得血糖濃度。以血糖峰值>16.7mmol/L和負(fù)荷后120min血糖>11.1mmol/L診為糖尿病，若只具備其中一個(gè)條件則為糖耐量減低。到30周時(shí)，共有16只OLETF大鼠作為實(shí)驗(yàn)組模型。之后隨機(jī)分為兩組（n=8），RGZ組灌以羅格列酮稀釋液，劑量為3mg/kg·d。

4、DM組和NC組灌以等量蒸餾水，每日1次灌胃12周。
　　三組大鼠分別采集血液進(jìn)行測(cè)量，之后三組大鼠同時(shí)處死，分別取肝臟組織。放血后以無菌器械迅速取肝臟組織3塊，其中2塊分別放入DEPC處理過的凍存管中，丟入液氮保存?zhèn)溆茫?塊置于10%的福爾馬林中，行石蠟包埋切片。之后進(jìn)行組織學(xué)染色，包括：HE染色、AO染色、Schiff實(shí)驗(yàn)、Masson三色染色、氯化金染色和免疫組織化學(xué)染色。觀察大鼠肝臟組織學(xué)變化、測(cè)定肝肝巨噬細(xì)胞和肝儲(chǔ)脂細(xì)胞數(shù)

5、量的變化、觀察肝臟組織細(xì)胞RNA變化、膠原纖維的變化以及IL-17和Bcl-xL的陽性表達(dá)改變。另外，用置于-70℃的肝臟組織制成組織勻漿來，羥脯氨酸法測(cè)定膠原蛋白的含量。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠一般狀況比較：與LETO大鼠相比，OLETF大鼠體型較為肥胖，神經(jīng)較為敏感易激怒，懶動(dòng)畏寒，精神萎靡、焦慮，且肝臟體積明顯變大。
　　2.生化指標(biāo)的改變：處死大鼠之前分別測(cè)得OLE

6、TF大鼠餐后兩小時(shí)血糖，甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶以及肝指數(shù)。與NC組相比，DM組餐后兩小時(shí)血糖，甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶和肝指數(shù)指標(biāo)均有明顯升高，RZG組與DM組相比，DM組餐后兩小時(shí)血糖，甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶有顯著降低，但谷草轉(zhuǎn)氨酶無明顯差異。
　　3.肝臟組織學(xué)變化：NC組大鼠肝小葉規(guī)則，肝細(xì)胞索呈放射狀整齊排列，肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞核圓居中，胞質(zhì)均勻，沒有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DM組肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞索

7、變窄，肝血竇界限不清，肝細(xì)胞腫脹、脂肪變，壞死，偶見點(diǎn)狀炎性灶。RGZ肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚清晰，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)排列尚整齊，雖然也存在脂性空泡和炎性細(xì)胞，但較糖尿病對(duì)照組明顯減少
　　4.肝臟肝巨噬細(xì)胞的比較：通過觀察HE染色結(jié)果，計(jì)數(shù)各組織中肝巨噬細(xì)胞的數(shù)量，NC組肝巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果為17.05±0.89，DM組肝巨噬細(xì)胞數(shù)量為25.31±1.23，RGZ組結(jié)果為38.61±4.02。結(jié)果顯示DM組較NC組相對(duì)增多，但RGZ組肝巨噬細(xì)胞結(jié)果

8、較NC組和DM組都明顯增加（P<0.01）。
　　5.肝臟肝細(xì)胞糖原含量的變化：NC組肝糖原定位于胞漿，分布均勻密集，糖原顆粒染色均一呈粉紅色。DM組肝細(xì)胞腫脹、擁擠，糖原分布疏松，糖原顆粒不明顯。RGZ組肝糖原較糖尿病組密布，顆粒相對(duì)均一。測(cè)定肝細(xì)胞糖原顆?；叶?，NC組肝細(xì)胞糖原的灰度值為62.38±10.16，DM組（109.54±11.18）與NC組相比明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），RGZ組（79.36±9.98

9、）與NC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與DM組相比明顯降低（P<0.05）。
　　6.肝臟組織RNA含量變化：吖啶橙熒光染色使正常細(xì)胞核DNA呈綠色或黃綠色均勻熒光，細(xì)胞質(zhì)和核仁的RNA染為桔黃（紅）色熒光，測(cè)定胞質(zhì)中RNA熒光染色灰度，與NC組（47.21±8.72）相比，DM組（89.84±10.71）和RGZ組（61.25±8.13）灰度值增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與DM組相比，RGZ組灰度值降低(P<0.05)。

10、r>　　7.肝臟儲(chǔ)脂細(xì)胞（HSC）的觀察：肝臟儲(chǔ)脂細(xì)胞位于狄氏間隙和肝細(xì)胞之間，經(jīng)氯化金染色使得肝儲(chǔ)脂細(xì)胞呈紫褐色，背景淡灰色。通過高倍鏡下儲(chǔ)脂細(xì)胞計(jì)數(shù)，與NC組肝儲(chǔ)脂細(xì)胞（2.75±0.21）相比DM組（7.19±0.45）升高（P<0.01），與DM組相比RGZ組儲(chǔ)脂細(xì)胞數(shù)值（4.93±0.48）降低(P<0.01)。
　　8.膠原纖維的變化：NC組大鼠肝小葉中央靜脈管壁薄，門管區(qū)有少量結(jié)締組織，其所占面積的百分比為[(3.1

11、9±0.75)%]，與NC組相比，DM組[(15.87±0.63)%]肝小葉中央靜脈管壁增厚，門管區(qū)結(jié)締組織增多，膠原沉積（P<0.01），與DM組相比，RGZ組[(10.06±0.54)%]在門管區(qū)可見纖維間隔，較DM組膠原纖維減少（P<0.05）。
　　9.膠原蛋白含量的比較：高效液相色譜法測(cè)定每克肝臟組織中的膠原蛋白的含量，與NC組（64.52±21.51 mg/g）相比，DM組（134.54±18.78 mg/g）膠原蛋白

12、含量明顯增加（P<0.01），RGZ組(91.59±10.75 mg/g）低于DM組（P<0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　10.肝臟組織IL-17表達(dá)變化：與NC組成肝臟IL-17陽性表達(dá)吸光度值（0.129±0.045）相比，DM組（0.520±0.021）升高(P<0.01)，而RGZ組（0.235±0.034）低于DM組(P<0.01)。
　　11.肝臟組織Bcl-xl表達(dá)變化：與NC組肝臟組織Bcl-xL陽性表達(dá)吸光

13、度值（0.613±0.014），DM組（0.242±0.041）降低(P<0.05)，RGZ組肝臟組織Bcl-xL陽性表達(dá)（0.369±0.048）較DM組升高(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.糖尿病大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹，膠原纖維沉積，膠原蛋白含量明顯增加。
　　2.糖尿病組HSC細(xì)胞活化增生，導(dǎo)致肝膠原纖維含量增加。
　　3.糖尿病組肝小葉和門管區(qū)炎性細(xì)胞增多，可能與肝巨噬細(xì)胞數(shù)量增加有關(guān)；過多