意蜂哺育蜂與采集蜂頭部mRNAs與miRNAs表達(dá)譜Solexa測序比較分析及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究.pdf

1、蜜蜂是社會性昆蟲，是公認(rèn)的研究復(fù)雜社會行為進(jìn)化和分子神經(jīng)機(jī)制的模式生物。蜜蜂有著復(fù)雜的行為活動，成年蜜蜂一般在羽化后的2-3周從事巢內(nèi)工作，其中哺育幼蟲的工蜂為哺育蜂，接下來的1-3周，大多數(shù)的蜜蜂則從事巢外工作，其中采集花粉花蜜的工蜂為采集蜂，蜜蜂這種從哺育到采集的行為轉(zhuǎn)變與其日齡、生理、環(huán)境、腦部結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)及調(diào)控密切相關(guān)。本研究利用新一代高通量測序技術(shù)分別檢測了意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)哺育蜂

2、和采集蜂頭部mRNA和miRNA的表達(dá)情況，同時比較這兩者之間表達(dá)差異的基因，以尋找與蜜蜂行為轉(zhuǎn)變相關(guān)的重要基因。采用生物信息學(xué)方法，分析了差異顯著性表達(dá)的miRNAs和mRNAs的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。本研究的這些結(jié)果為更好地理解蜜蜂行為轉(zhuǎn)變的重要基因及其表達(dá)調(diào)控提供重要線索。主要結(jié)果如下:
　　 1.哺育蜂與采集蜂頭部mRNAs的Solexa高通量測序比對
　　 為尋找哺育蜂和采集蜂頭部表達(dá)差異的基因，本研究采用了數(shù)字化表達(dá)

3、譜技術(shù)，即利用新一代高通量測序技術(shù)Solexa/Illumina平臺檢測哺育蜂和采集蜂頭部的基因表達(dá)。結(jié)果表明，在兩種蜜蜂中都得到豐富標(biāo)簽序列，在哺育蜂和采集蜂中分別得到3422327和4286250個序列標(biāo)簽;通過與GenBank內(nèi)已知基因的比對，發(fā)現(xiàn)其中分別有173532個（哺育蜂）和426047個（采集蜂）標(biāo)簽序列未能匹配;在哺育蜂和采集蜂中分別檢測到6875和7508個已知基因，分別占總基因數(shù)的72.47％和79.14％;比較這

4、兩組蜜蜂的基因表達(dá)情況，其中表達(dá)量最高的10個基因中都包含多種王漿主蛋白基因、葡萄糖氧化酶基因和防衛(wèi)素基因;差異分析篩選發(fā)現(xiàn)有1434個基因的表達(dá)是差異顯著的，即基因在哺育蜂和采集蜂之間的表達(dá)量之比（采集蜂/哺育蜂）大于2，且False Discovery Rate(FDR)值小于0.001，其中1337在采集蜂中上調(diào)，97個基因下調(diào)。此外，通過Gene Ontology功能顯著性富集分析和Pathway顯著性富集分析，發(fā)現(xiàn)在顯著差異的

5、基因中，有415個基因是在屬于GO cellular component分類，同時還發(fā)現(xiàn)這些顯著差異基因參與了200個Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路，其中包括21條信號通路，而過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路是富集強(qiáng)度最大的。
　　 2.哺育蜂與采集蜂頭部microRNAs的Solexa高通量測序比對
　　 MicroRNAs是內(nèi)源性的非編碼小

6、RNA，長度大約為22個核苷酸，這些小的miRNA通常靶向一個或者多個mRNA，通過在翻譯水平的抑制或者裂解靶標(biāo)mRNA來調(diào)控生物體基因的表達(dá)。本實驗采用第二代高通量技術(shù)Illumina測序平臺檢測哺育蜂和采集蜂頭部sRNAs，尋找與行為轉(zhuǎn)變相關(guān)的miRNAs。結(jié)果表明，哺育蜂和采集蜂頭部都含有豐富的小RNAs，而且那些小RNA的長度大多集中在22個核苷酸(nt)左右。結(jié)合高通量測序和生物信息學(xué)分析，本研究發(fā)現(xiàn)，哺育蜂和采集蜂中有9個表

7、達(dá)差異顯著的miRNAs，即P值小于0.01，同時這些基因在哺育蜂和采集蜂間的表達(dá)量相比倍數(shù)大于或者等于2，其中部分miRNAs的目標(biāo)基因與神經(jīng)功能相關(guān)。本研究同時還在哺育蜂和采集蜂中發(fā)現(xiàn)了67個新的miRNAs。其中16個miRNAs通過莖環(huán)RT-PCR得到進(jìn)一步的驗證。通過熒光定量PCR驗證了ame-miR-31a和ame-miR-13b的顯著差異性，證明了高通量測序的可靠性及可行性。這些研究結(jié)果為了解蜜蜂中的miRNAs提供新的信

8、息，同時為更好理解miRNAs在蜜蜂發(fā)育過程中的調(diào)控功能提供幫助。
　　 3.哺育蜂和采集蜂頭部mRNA和miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析
　　 通過miranda v3.3a軟件預(yù)測哺育蜂和采集蜂中顯著性差異表達(dá)的9個miRNAs的靶基因，發(fā)現(xiàn)幾乎每個miRNA都對應(yīng)眾多的靶基因。結(jié)合差異表達(dá)mRNA與miRNA進(jìn)行整合分析，通過Cytoscape2.8.2版軟件構(gòu)建miRNA和mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示miRNA的靶基因很豐富

9、，同時有很多mRNA同時受多個miRNAs的調(diào)節(jié)。哺育蜂中4個上調(diào)的miRNAs，作用于37個下調(diào)基因和2個上調(diào)基因;下調(diào)的5個miRNAs作用的表達(dá)差異性的靶基因有55個，其中只有2個是上調(diào)基因，其余都是下調(diào)基因。利用DAVID對差異表達(dá)miRNA調(diào)控的表達(dá)上調(diào)和上調(diào)的靶基因進(jìn)行GO和Pathway分析。GO分析結(jié)果顯示，受miRNA的所有表達(dá)差異顯著性的基因中，只有7個有GO分類，并且都屬于GO分類中的cellular compon