新型細胞膜色譜的建立及黃連黃精配伍藥效物質(zhì)的初步研究.pdf

1、目的：優(yōu)化細胞膜色譜柱的制備條件，建立新型細胞膜色譜模型。以細胞膜色譜為工具考察中藥黃連、黃精配伍中具有改善胰島素抵抗作用的成分，確定黃連黃精配伍的藥效物質(zhì)。
　　方法：1、探討黃連、黃精及其二者配伍的降血糖活性。2、考察離體細胞膜的保存方法，選用BCA蛋白濃度測定法考察細胞膜在固定相磁性微球表面的最適吸附平衡量以及吸附平衡時間，進一步優(yōu)化細胞膜色譜的制備條件。3、建立胰島細胞膜磁性微球-離線UPLC模型、HepG2細胞萃取-離線

2、UPLC模型以及3T3-L1脂肪細胞萃取-離線HPLC模型，并采用上述色譜模型分析中藥黃連、黃精中具有改善胰島素抵抗作用的藥效物質(zhì)。4、通過胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗實驗，驗證細胞膜色譜模型篩選得到的化合物的活性。
　　結(jié)果：1、中藥黃連、黃精提取液的藥理結(jié)果表明，黃連組、黃精組與模型組比較均可增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的利用率（P<0.01）；黃連組及黃精組的細胞上清中的游離脂肪酸濃度均明顯降低，與

3、模型組比較存在顯著性差異（P<0.01）。2、穩(wěn)定性試驗表明，0.9％ NaCl，1% BSA組成的穩(wěn)定劑在0-9 h內(nèi)可延緩細胞膜表面ATP酶活性的衰減，這保證了細胞膜受體與活性物質(zhì)結(jié)合、發(fā)揮分離作用的物質(zhì)基礎。3、通過細胞膜與磁性微球吸附量以及吸附時間的考察，得知細胞膜初始蛋白濃度為1.2 mg/mL，制備時間為6 h。4、通過將胰島細胞膜與毛細管結(jié)合制備細胞膜毛細管色譜模型，該模型可減少靶細胞膜的用量，同時將細胞膜與磁性微球結(jié)合制

4、備胰島細胞膜磁性微球-離線色譜模型，用于“垂釣”中藥黃連、黃精中的降血糖活性物質(zhì)。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)方法相比，將細胞膜固定于磁性微球表面“垂釣”中藥中活性物質(zhì)，結(jié)合色譜質(zhì)譜分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法，無需填充色譜柱，平衡色譜體系，簡化了分析過程。本文采用該法鑒定了黃連中小檗堿等5個化合物，黃精中6,8-二甲基-4',5,7-三羥基高異黃烷酮等4個化合物。5、鑒于有些活性物質(zhì)通過與細胞信號通路發(fā)生相互作用，本文建立了胰島素抵抗3T3-L1細胞萃取-

5、離線HPLC模型和胰島素抵抗HepG2細胞萃取-離線UPLC模型。中藥提取液與細胞共同孵育，得到細胞內(nèi)容物，借助于UPLC、HPLC、HPLC-MS等色譜手段，分析活性物質(zhì)。采用HepG2細胞萃取-離線UPLC法從黃連中分離得到小檗堿等5種生物堿；采用3T3-L1細胞萃取-離線HPLC法分離、鑒定結(jié)果：黃連中分離得到藥根堿等5種化合物，黃精中分離得到6,8-二甲基-4',5,7-三羥基高異黃烷酮等4種化合物，黃連黃精配伍組中分離得到小檗

6、堿等8種化合物；在葡糖糖消耗實驗顯示了它們與模型組有顯著性差異（P<0.05），結(jié)果表明這些物質(zhì)可改善胰島素抵抗。
　　結(jié)論：本文所建立的3T3-L1脂肪細胞萃取色譜、HepG2細胞萃取色譜以及胰島細胞膜磁性微球色譜等新型細胞膜色譜可用于中藥藥效物質(zhì)的研究。通過上述方法對黃連、黃精及其二者配伍的初步研究表明黃連中含有的小檗堿等異喹啉型生物堿以及黃精中含有的高異黃酮類成分具有一定的改善胰島素抵抗活性。因分離得到的化合物結(jié)構(gòu)類型不同，