經(jīng)APTES共價(jià)修飾后的細(xì)胞膜色譜新技術(shù)的研發(fā)及應(yīng)用.pdf

1、細(xì)胞膜色譜(Cell Membrane Chromatography，CMC)是一種將細(xì)胞膜提取后鍵合到固定相表面的生物色譜，它結(jié)合了生物材料的生物學(xué)活性以及傳統(tǒng)分析色譜法在線分離、高通量的優(yōu)勢，使得從中藥等復(fù)雜體系中篩選出有效的活性成分成為可能，而且更加高效、便利。中藥具有整體性、復(fù)雜性的特點(diǎn)，這些特點(diǎn)賦予了它多靶點(diǎn)、多途徑調(diào)節(jié)的優(yōu)勢和特色。然而，正是由于這些特性，導(dǎo)致中藥中的主要活性成分并不明確，其作用效果和現(xiàn)代理論基礎(chǔ)也較為薄弱，

2、主要的臨床應(yīng)用仍舊依賴幾千年來無數(shù)中醫(yī)前輩所積累的經(jīng)驗(yàn)所推理得到的富含辯證關(guān)系的中醫(yī)理論。細(xì)胞膜色譜作為一種新興的生物色譜技術(shù)，在中藥活性篩選的研究領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用。本研究在原有細(xì)胞膜色譜模型基礎(chǔ)之上進(jìn)行了創(chuàng)新，研發(fā)出一種新型的經(jīng)APTES修飾后的細(xì)胞膜色譜模型，并對(duì)新型細(xì)胞膜色的模型的方法學(xué)進(jìn)行了考察和優(yōu)化，在中藥活性成分篩選領(lǐng)域內(nèi)多方面開展了應(yīng)用研究，從而為細(xì)胞膜色譜制備的進(jìn)一步科學(xué)化、規(guī)范化、合理化提供依據(jù)，并有利于進(jìn)一步

3、拓展細(xì)胞膜色譜的應(yīng)用范圍。
　　1.新型經(jīng)APTES修飾的細(xì)胞膜色譜方法學(xué)的建立及考察
　　細(xì)胞膜色譜是一種新型的生物親合色譜，該模型使用特定細(xì)胞膜鍵合于硅膠上作為色譜固定相。但是細(xì)胞膜色譜存在壽命較短，易失活等問題，一直以來影響細(xì)胞膜色譜的普及。除此以外，由于不同實(shí)驗(yàn)室制備條件不一致，還存在重現(xiàn)性較差的問題。因此本章針對(duì)細(xì)胞膜色譜柱壽命較短的問題，創(chuàng)新性地采用了一種新型的經(jīng)過（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷((3-aminop

4、ropyl)triethoxysilane，APTES）共價(jià)修飾后的硅膠應(yīng)用到了細(xì)胞膜色譜的制備過程中。本研究首次提出使用共價(jià)修飾的方法，研發(fā)新型的細(xì)胞膜色譜技術(shù)。其原理就是利用APTES作為橋梁，在硅膠表面鍵合了醛基，該醛基可以與細(xì)胞膜上豐富的氨基基團(tuán)以共價(jià)鍵的形式結(jié)合。通過這種方式，細(xì)胞膜和硅膠間的結(jié)合力將會(huì)極大增強(qiáng)，從而使得細(xì)胞膜的脫落失活現(xiàn)象得到一定程度的緩解。經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察，所制備的新型的經(jīng)APTES共價(jià)修飾的細(xì)胞膜色譜柱可以具有

5、更高的柱效和更長的壽命，從原有的不足3天提高到現(xiàn)在的12天左右。為了解決重現(xiàn)性較差的問題，本研究還對(duì)新建立的經(jīng)APTES共價(jià)修飾的細(xì)胞膜色譜法進(jìn)行了方法學(xué)考察，對(duì)細(xì)胞膜色譜制備過程的關(guān)鍵步驟進(jìn)行了考察，如細(xì)胞量、細(xì)胞破碎條件等，并制定了相應(yīng)的用量標(biāo)準(zhǔn)和操作規(guī)程。
　　2.經(jīng)APTES修飾的MCF7全二維細(xì)胞膜色譜的構(gòu)建及其應(yīng)用
　　為進(jìn)一步擴(kuò)展在第一章基礎(chǔ)上所搭建好的經(jīng)共價(jià)修飾后的新型細(xì)胞膜色譜模型的應(yīng)用，并探索闡明中藥元胡

6、的抗癌作用機(jī)制，篩選中藥元胡中的潛在抗癌活性成分或者藥物前體，在本章中，擬選用元胡作為中藥材的研究對(duì)象，通過使用MCF7細(xì)胞系構(gòu)建經(jīng)APTES修飾的MCF7細(xì)胞膜色譜，在線對(duì)元胡提取液中的各組分進(jìn)行高通量篩選。在確保APTES修飾的2D MCF7/CMC-C18柱/TOF-MS系統(tǒng)的穩(wěn)定性、選擇性的基礎(chǔ)上，我們從中藥元胡中篩選鑒別到了3種潛在活性化合物，即氧海罌粟堿、普魯托品、小檗堿。這三種活性成分可以有效地對(duì)MCF7細(xì)胞進(jìn)行濃度依賴性

7、的殺傷，其在MCF7細(xì)胞中的IC50值分別為36.16μM、29.30μM和45.52μM;且經(jīng)過細(xì)胞凋亡和死亡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察后發(fā)現(xiàn)，這三種活性成分主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮藥效的。本研究結(jié)果表明所構(gòu)建的經(jīng)APTES修飾后的2D MCF7/CMC-C18柱/TOF-MS系統(tǒng)是一種用于中藥抗乳腺癌活性成分篩選的可行方法。
　　3.經(jīng)APTES修飾的DU145全二維細(xì)胞膜色譜的構(gòu)建及其應(yīng)用
　　為進(jìn)一步確證經(jīng)共價(jià)修飾后的新型細(xì)胞

8、膜色譜模型的有效性，從而為細(xì)胞膜色譜的進(jìn)一步發(fā)展應(yīng)用探索道路，本章在第一章、第二章基礎(chǔ)上所搭建好的經(jīng)共價(jià)修飾后的新型細(xì)胞膜色譜模型基礎(chǔ)上，探索篩選中藥元大黃、黃芩中的潛在抗癌活性成分或者藥物前體。在本章中，擬選用大黃和黃芩作為中藥材的研究對(duì)象，通過使用經(jīng)APTES修飾后的硅膠，構(gòu)建了2D DU145/CMC-C18柱/TOF-MS系統(tǒng)，在線對(duì)大黃和黃芩提取液中的各組分進(jìn)行高通量篩選。在確證經(jīng)APTES修飾的2DDU145/CMC-C18

9、柱/TOF-MS系統(tǒng)的選擇性、適用性的基礎(chǔ)上，我們從中藥大黃和黃芩中篩選鑒別到了三種潛在活性化合物，即木蝴蝶素A、丹葉大黃素和大黃素。經(jīng)過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的考察，發(fā)現(xiàn)這三種活性成分均可以有效地對(duì)DU145細(xì)胞進(jìn)行濃度依賴性的殺傷，其在DU145中的IC50分別為151.1μM、55.66μM和85.81μM;且經(jīng)過細(xì)胞凋亡和死亡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察后，進(jìn)一步確證了這三種活性成分的藥效，并發(fā)現(xiàn)其藥效作用主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮藥效的。本研究結(jié)果表

10、明所構(gòu)建的經(jīng) APTES修飾后的2D DU145/CMC-C18柱/TOF-MS分析系統(tǒng)是一種從中藥中篩選抗前列腺癌活性成分的可行方法。
　　4.經(jīng)APTES修飾的全二維HepG2干細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)的構(gòu)建及其應(yīng)用
　　最近一段時(shí)間，腫瘤干細(xì)胞的研究在抗癌研究領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注。它們是一類具有自我更新能力的特殊腫瘤細(xì)胞，在腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和遷移中發(fā)揮著重要作用。殺死腫瘤干細(xì)胞將會(huì)顯著提高腫瘤的治愈率，同時(shí)也能大大降低腫瘤的

11、復(fù)發(fā)率。但是通常來說分離和培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞是十分困難且耗時(shí)的過程，獲得足夠量的腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)，對(duì)我們的實(shí)驗(yàn)要求也更高、更苛刻。而我們新建立的APTES修飾的細(xì)胞膜色譜壽命長、效率高，恰好十分適用于腫瘤干細(xì)胞。因此在本研究中，我們通過APTES修飾的硅膠建立了一種新的HepG2-CSC/CMC，并選擇一種著名的中藥丹參（Salvia miltiorrhiza，其炮制部位為唇形科植物丹參的干燥根和根莖）作為理想的中藥復(fù)雜體系進(jìn)行活性

12、成分篩選。有報(bào)道研究證明，在1981至2006年之間，臨床上70％的新批藥物來源于天然產(chǎn)物。因此從中藥中篩選出潛在的具有抗腫瘤干細(xì)胞的活性成分是一項(xiàng)很有前景的研究。此外，根據(jù)本課題組的前期研究報(bào)道，我們還擬采用全二維色譜法，以進(jìn)一步提高CMC的分離度。在這些條件下，本研究搭建了一個(gè)經(jīng)APTES共價(jià)修飾的HepG2腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞膜色譜全二維分析系統(tǒng)，對(duì)丹參中的活性成分進(jìn)行了篩選，得到了丹參酮IIA、隱丹參酮、二氫丹參酮I這三種潛在活性成分

13、。結(jié)合后期的細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)考察得到其IC50值分別為10.300μM，17.850μM，2.53μM，然后通過細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證其藥效，并利用虛擬對(duì)接技術(shù)，確證其潛在藥效作用靶點(diǎn)可能為細(xì)胞膜上的VEGFR。使用經(jīng)APTES修飾的硅膠構(gòu)建的全二維細(xì)胞膜色譜是一種有效的從復(fù)雜體系（如中藥等）中篩選具有潛在抗癌活性的目標(biāo)化合物的新方法，特別是對(duì)于一些珍稀的、較難以獲得的生物材料。
　　總之，針對(duì)細(xì)胞膜色譜應(yīng)用過程中所面臨的柱壽命短

14、、穩(wěn)定性差的問題，本課題通過對(duì)硅膠表面進(jìn)行共價(jià)修飾，創(chuàng)新性地利用APTES在硅膠表面鍵和醛基從而與細(xì)胞膜表面大量的游離氨基形成共價(jià)鍵，首次通過共價(jià)修飾的方式延長了細(xì)胞膜色譜柱壽命并提高其穩(wěn)定性。后續(xù)系統(tǒng)考察優(yōu)化了細(xì)胞膜色譜制備方法學(xué)，制訂了一系列標(biāo)準(zhǔn)，從而保證新搭建的細(xì)胞膜色譜模型的重現(xiàn)性。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建新型MCF7、DU145和HepG2干細(xì)胞的全二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)應(yīng)用于中藥抗腫瘤活性組分的篩選，大大提升了通量，篩選到抗乳腺癌、抗