基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在風(fēng)濕性二尖瓣組織中的表達(dá)及意義.pdf

1、風(fēng)濕性心臟病(Rheumatic Heart Disease，RHD)簡稱風(fēng)心病，是風(fēng)濕性炎癥所致的包括心內(nèi)膜、心肌、心外膜、心包及傳導(dǎo)系統(tǒng)在內(nèi)的全心臟炎，但永久性損害往往局限于心臟瓣膜，其中單純二尖瓣病變最為常見，占95％～98％。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMPs)是一類鋅依賴的蛋白水解內(nèi)肽酶，能特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)，主要

2、參與ECM的重構(gòu)過程。金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue Inhibitor of Metalloproteinases，TIMPs)是機體存在的MMPs的內(nèi)源性特異性抑制劑，與調(diào)節(jié)MMPs的活動密切相關(guān)。
　　 MMPs的表達(dá)和調(diào)控失衡可以引起多種疾病，如心血管疾病、肺部疾病、關(guān)節(jié)炎、腫瘤等。因此，MMPs與疾病的關(guān)系已經(jīng)成為眾多國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。
　　 本研究分兩部分，旨在觀察MMPs/TIMPs在風(fēng)濕性病變的二

3、尖瓣組織中的表達(dá)狀態(tài)，了解其表達(dá)高低與病理類型、臨床心功能分級、心房顫動的關(guān)系，進而探討風(fēng)濕性二尖瓣組織基質(zhì)重構(gòu)的機制。
　　 第一部分基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在風(fēng)濕性二尖瓣組織中的表達(dá)。
　　 目的：
　　 1.觀察RHD二尖瓣組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化；
　　 2.探討MMPs及TIMPs在風(fēng)濕性二尖瓣組織中的表達(dá)水平及意義。
　　 方法：
　　 1.實驗分組：將16例于2007年6月～11

4、月期間在廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院心胸外科接受二尖瓣置換手術(shù)的成人RHD患者的二尖瓣前、后瓣葉組織作為實驗組，另取7例無心臟病變的成人意外死亡者二尖瓣前、后瓣葉組織作為對照組。
　　 2.病理學(xué)檢查：所有標(biāo)本行HE染色，觀察實驗組和對照組的組織學(xué)變化。選取典型RHD患者的二尖瓣前、后瓣葉制作電鏡標(biāo)本，在透射電子顯微鏡(TEM)下觀察二尖瓣組織膠原纖維及線粒體等變化。
　　 3.采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)測

5、定實驗組和對照組MMP-2、MMP-13及TIMP-1、TIMP-2的mRNA表達(dá)水平，PCR擴增產(chǎn)物電泳圖像掃描后測定目的基因和β-actin基因的電泳條帶灰度積分，以二者比值表示待測基因mRNA相對含量。
　　 4.采用免疫組織化學(xué)染色(SABC法)對實驗組和對照組二尖瓣前、后瓣葉組織中MMP-2、MMP-13、TIMP-1及TIMP-2進行染色，光鏡觀察后應(yīng)用HPAIS1000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)采集圖像，Imag

6、e-Pro Plus version6.0軟件對MMP-2、MMP-13的表達(dá)水平進行積分光密度(IOD)測定，取其平均值作為量化指標(biāo)，比較兩組MMP-2、MMP-13的蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.與對照組相比，實驗組HE染色顯示瓣膜結(jié)構(gòu)不清，纖維組織增生，粘液樣變性，膠原纖維玻璃樣變性、鈣化等改變。電子顯微鏡觀察顯示典型RHD二尖瓣組織膠原纖維增生，排列紊亂、斷裂；線粒體腫脹、聚集，部分出現(xiàn)空泡樣變。

7、>　　 2.RT-PCR結(jié)果顯示實驗組MMP-2、MMP-13及TIMP-1、TIMP-2的mRNA表達(dá)水平較對照組均顯著增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.109，P=0.005；t=2.862，P=0.009；t=2.357，P=0.028；t=2.844，P=0.010)。
　　 3.與對照組相比，實驗組免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示層次不清，可見較多新生血管形成；MMP-2、MMP-13及TIMP-1、TIMP-2在瓣膜的間質(zhì)細(xì)胞

8、、內(nèi)皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞等胞漿中表達(dá)增多；實驗組MMP-2、MMP-13的IOD值高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.633，P=0.008；Z=-2.936，P=0.003)。
　　 結(jié)論：
　　 1.風(fēng)心病二尖瓣前、后瓣葉組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)均顯示其細(xì)胞外基質(zhì)有明顯病理改變，即纖維組織增生，粘液樣變性，膠原纖維排列紊亂、斷裂和玻璃樣變性、鈣化。
　　 2.風(fēng)濕性二尖瓣組織中MMP-2、MMP-13及TIMP-

9、1、TIMP-2的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平顯著增加，提示MMPs/TIMPs表達(dá)上調(diào)可能是RHD二尖瓣細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的重要分子機制，為進一步研究和防止RHD瓣膜基質(zhì)重構(gòu)提供了理論依據(jù)。
　　 第二部分基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的表達(dá)與二尖瓣風(fēng)濕性改變的病理類型、臨床心功能分級及心房顫動的關(guān)系
　　 目的：
　　 1.比較在不同二尖瓣病理類型、臨床心功能分級及有無心房顫動時超聲心動圖主要檢測指標(biāo)的變化；

10、　　 2.研究風(fēng)濕性二尖瓣不同病理類型、臨床心功能分級及有無心房顫動對二尖瓣組織中MMPs、TIMPs基因表達(dá)水平的影響。
　　 方法：
　　 1.研究對象：選取于2007年6月～11月期間在廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院心胸外科接受二尖瓣置換手術(shù)的16例RHD患者為研究對象，其中男3例，女13例，平均年齡42.06歲。根據(jù)病理類型分為二尖瓣狹窄為主的MS組(二尖瓣口面積<1.2cm2，反流()2+)和二尖瓣關(guān)閉不全為主的MR組(

11、二尖瓣口面積>1.2cm2，反流3+～4+)，根據(jù)臨床心功能分級(NYHA標(biāo)準(zhǔn))分為心功能Ⅲ～Ⅳ級組(A組)和心功能Ⅱ級組(B組)，根據(jù)有無心房顫動分為心房顫動組(Ⅰ組)和竇性心律組(Ⅱ組)。
　　 2.檢測內(nèi)容：收集臨床資料，采用美國Agilent SONOS5500多普勒超聲診斷儀，于手術(shù)前2-5天對患者進行常規(guī)心臟超聲檢查。病人左側(cè)臥位，取標(biāo)準(zhǔn)胸骨旁長軸切面，測量左房內(nèi)徑(LAd)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)，計算左室射

12、血分?jǐn)?shù)(LVEF)和短軸縮短率(LVFS)。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)測定RHD患者二尖瓣組織中MMP-2、MMP-13、TIMP-1及TIMP-2的mRNA表達(dá)水平，PCR擴增產(chǎn)物電泳圖像掃描后測定目的基因和β-actin基因的電泳條帶灰度積分，以二者比值表示待測基因mRNA相對含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.超聲心動圖檢測結(jié)果分析，MS組與MR組比較，前者左室舒張末期內(nèi)徑小于后者，且差異有統(tǒng)計

13、學(xué)意義(t=-3.429，P=0.004)。A組與B組比較，超聲心動圖各檢測指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。Ⅰ組與Ⅱ組比較，前者左房內(nèi)徑較后者顯著增大，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.209，P=0.044)。
　　 2.MS組與MR組、A組與B組比較，MMP-2、MMP-13及TIMP-1、TIMP-2的mRNA表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；而Ⅰ組與Ⅱ組比較，MMP-2、MMP-13的mRNA表達(dá)水平高于后者，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2

14、.681，P=0.018；t=2.392，P=0.031)。
　　 結(jié)論：
　　 1.風(fēng)心病以二尖瓣關(guān)閉不全為主的患者其左室舒張末期內(nèi)徑較以二尖瓣狹窄為主的患者明顯增大，表明病理類型與左心室構(gòu)型改變有關(guān)；心房顫動患者左房內(nèi)徑較竇性心律者明顯增大，表明心房顫動與左心房構(gòu)型改變有關(guān)。
　　 2.風(fēng)濕性二尖瓣不同病理類型和臨床心功能分級對該瓣膜組織中MMPs、TIMPs的表達(dá)水平無明顯影響。心房顫動的出現(xiàn)與存在伴隨MM