水稻大規(guī)模增強子捕獲系群體的創(chuàng)建與初步分析.pdf

1、水稻(Oryza sativa L.)是最重要的糧食作物之一,具有較小的基因組(430Mb),與其他禾本科植物的基因組具有良好的共線性,易于體外操作與分化,是研究單子葉植物基因組的模式植物.近年來水稻基因組研究取得了很大進展,構(gòu)建了遺傳圖譜和物理圖譜,完成了秈稻和粳稻的全基因組草圖測序(Yu et al.,2002;Goffet al.,2002),2002年12月18日國際水稻基因組測序計劃工作組在東京宣布,國際水稻基因組測序計劃已圓

2、滿完成,共測定堿基對366,000kb,精確度達到99.99﹪,并預(yù)測遺傳基因62,435個.在此基礎(chǔ)上,許多實驗室開始大規(guī)模地、系統(tǒng)地進行水稻基因功能的研究.建立水稻突變體庫是功能基因組學(xué)研究的有效手段,而高效的水稻轉(zhuǎn)化體系是建立突變體庫的重要基礎(chǔ).該研究正是在建立起了高效水稻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系基礎(chǔ)上,構(gòu)建了一個大規(guī)模的水稻增強子捕獲群體,并對其進行了分子鑒定,初步建立起適合該群體的擴增T-DNA側(cè)翼序列的PCR-walking技術(shù)體系,

3、已擴增了部分突變體基因組中的T-DNA側(cè)翼序列,并對部分側(cè)翼序列進行了測序分析.該研究是國家"863"計劃項目"水稻突變體庫的建立"的一部分,在這兩年的研究中,在與實驗室全體人員的共同努力下,取得了以下幾個方面的進展:1.在農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化中,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后的愈傷組織在選擇培養(yǎng)基上的繼代培養(yǎng)的時機對抗性愈傷組織產(chǎn)生和正常生長有很大的影響,最佳的時機是在選擇培養(yǎng)10~15天后進行繼代培養(yǎng),這樣90﹪以上的愈

4、傷組織可以產(chǎn)生能健康生長的抗性愈傷組織;發(fā)現(xiàn)抗性愈傷組織在選擇培養(yǎng)基上的繼代培養(yǎng)時間對后邊的分化效率有至關(guān)重要的影響,抗性愈傷組織繼代培養(yǎng)4~12天可以有比較高的分化率,超過16天或少于2天,分化率急劇降低.抗性愈傷組織在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)8天時,分化率最高,達到85﹪;在胚性愈傷的誘導(dǎo)、共培養(yǎng)侵染菌液的最佳濃度的確定、共培養(yǎng)的時間以及轉(zhuǎn)化不同階段的最適培養(yǎng)基類型等方面的研究分析基礎(chǔ)上,優(yōu)化建立起一套高效、操作性強、適合水稻粳稻品種日本晴

5、(O. sativa spp.Japonica)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法體系.從愈傷組織誘導(dǎo)到得到水稻轉(zhuǎn)化體只需2.5月左右的時間.2.選用增強子捕獲質(zhì)粒(Enhancer-trapping vector)pFX-E24.2-15R,以粳稻日本晴為實驗材料,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,獲得了65,707個增強子捕獲T-DNA插入標簽系.經(jīng)PCR和Southern雜交檢測,表明95﹪以上的轉(zhuǎn)化體含有T-DNA插入片段.對T0代植株進行了Southern

6、雜交分析,T-DNA插入片段的單拷貝的植株約占43﹪,平均拷貝數(shù)為1.7.3.對11,560株T0代水稻轉(zhuǎn)化植株抽穗期的葉和未成熟種子進行了GUS組織化學(xué)染色,GUS基因在抽穗期種子部位和葉部的總表達率為27.23﹪,在葉部的表達率為10.07﹪,在胚的不同部位表達率為11.01﹪,在種皮的表達率為8.28﹪,在胚乳的表達率為3.42﹪.篩選出210個在這一生育期表達活性很強的增強子捕獲系,取樣并提取了DNA,以做進一步的研究.4.用P