基于譜-效相關(guān)的雷公藤效-毒物質(zhì)初步研究.pdf

1、目的：
　　雷公藤藥效明確，但同時(shí)其毒性明顯，臨床應(yīng)用受到限制，本研究以其為研究對(duì)象，探討研究其抗炎效應(yīng)和肝損傷物質(zhì)基礎(chǔ)，為提升雷公藤類(lèi)藥材質(zhì)量建立針對(duì)性的控制方法提供參考依據(jù)。
　　方法：
　　分別采集常用品種雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.和地方代用品種昆明山海棠Tripterygium hypoglaucum(Lévl.)Hutch藥材樣品共23批。
　　采用LC-Q/TO

2、F-MS技術(shù)表征不同產(chǎn)地雷公藤樣品的化學(xué)成分，液相方法:色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18600 Bar(1.8μm，2.1*100mm);流動(dòng)相:A: CH3CN(0.1％ HCOOH), B: H2O(0.1％ HCOOH);流速:0.3 mL·min-1;進(jìn)樣量:4μL;柱溫:30℃;樣品溫度:4℃;檢測(cè)波長(zhǎng):190-420nm;質(zhì)譜條件:離子源:ESI;毛細(xì)管電壓:4000 V;質(zhì)/核比范圍:

3、80-1000 m/z;脫溶劑氣溫度:225℃;脫溶劑氣流量:11 L/min;霧化器壓力:45 psig;鞘氣溫度:350℃;鞘氣流速:12 L/min;噴嘴電壓:500 V。并通過(guò)高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合文獻(xiàn)初步指認(rèn)其中10種主要成分;采用藥典指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，對(duì)全部藥材進(jìn)行相似度分析，進(jìn)一步進(jìn)行了不同基原藥材之間的相似度分析，以探索各批次藥材化學(xué)成分總體差異;對(duì)初步指認(rèn)的10種主要成分的豐度情況，采用SPSS軟件對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行系統(tǒng)

4、聚類(lèi)分析。
　　針對(duì)雷公藤肝細(xì)胞毒性和抗炎效應(yīng)，以正常人肝細(xì)胞（L02細(xì)胞系）為研究載體，對(duì)乙酰氨基酚為陽(yáng)性藥，細(xì)胞抑制率為檢測(cè)指標(biāo)，優(yōu)化建立肝細(xì)胞毒價(jià)檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地雷公藤及其地方習(xí)用品昆明山海棠藥材的肝細(xì)胞毒價(jià)，以巨噬細(xì)胞(BMDM)為研究載體，柳氮磺吡啶為陽(yáng)性藥，以驗(yàn)證因子白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)和一氧化氮合成酶(iNOS)為指標(biāo)，建立雷公藤體外抗炎效應(yīng)的檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)不同雷公藤樣品的體外抗炎

5、效應(yīng)。
　　基于譜-效相關(guān)分析，將化學(xué)檢測(cè)和生物檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，采用簡(jiǎn)單相關(guān)分析及多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法，分析雷公藤肝毒性和抗炎效應(yīng)成分，為其質(zhì)量控制提供可參考的依據(jù)。
　　結(jié)果：
　　(1)樣品采集與制備:本課題收集了兩種基原的23批雷公藤藥材，產(chǎn)地主要包括全國(guó)雷公藤的主產(chǎn)區(qū)，出膏率結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地藥材其出膏率差異較大。
　　(2)化學(xué)表征及指紋圖譜分析:從總體化學(xué)指紋圖譜上看，全部批次的雷公藤藥材化學(xué)成分差異較大

6、;不同基原、不同產(chǎn)地的雷公藤藥材化學(xué)成分差異不明顯;進(jìn)一步通過(guò)高分辨質(zhì)譜結(jié)合文獻(xiàn)相關(guān)報(bào)道，從提取離子流圖初步指認(rèn)了其中10種主要成分:雷公藤甲素(EIC+ M/Z:361.1641)，雷公藤堿戊(EIC+M/Z:780.2709)，雷公藤純堿(EIC+ M/Z:874.2764)，雷公藤內(nèi)酯(EIC+M/Z:313.1798)，雷公藤堿(EIC+ M/Z:884.2972)，雷公藤晉堿(EIC+M/Z:858.2815)，雷公藤次堿(E

7、IC+ M/Z:868.3022)，去甲基澤拉木醛(EIC+M/Z:481.2585)，雷公藤紅素(EIC+ M/Z:451.2848)，雷公藤酯甲(EIC+M/Z:455.3520);基于以上10種主要成分，采用SPSS軟件對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示:其中8批Tripterygium wilfordii Hook.f.基原藥材能很好的聚為一類(lèi)，說(shuō)明10種主要成分在雷公藤（T.wilfordii）藥材中有一定的聚集度。另外關(guān)注5批

8、Tripterygium hypoglaucum(Lévl.)Hutch基原藥材，樣本之間不能聚為一類(lèi)，說(shuō)明上述10種各主要鑒定成分在昆明山海棠（T.hypoglaucum）藥材中的含量差異總體較大。
　　(3)生物效價(jià)和毒價(jià):18份雷公藤樣品肝細(xì)胞毒價(jià)17.78～4131.4 U·g-1（相差超過(guò)200倍），5份昆明山海棠樣品肝細(xì)胞毒價(jià)209.42～7422.2 U·g-1（相差超過(guò)30倍），不同產(chǎn)地雷公藤及昆明山海棠藥材的肝細(xì)

9、胞毒價(jià)差異顯著;陽(yáng)性藥柳氮磺吡啶可顯著降低BMDM細(xì)胞上清液中IL-6及iNOS的濃度，且顯著提高IL-10的濃度，從而表現(xiàn)出良好的抗炎效果。18份雷公藤樣品抑制IL-6的作用顯著強(qiáng)于陽(yáng)性藥(P＜0.05)，7份雷公藤樣品促進(jìn)細(xì)胞釋放IL-10的作用顯著強(qiáng)于陽(yáng)性藥(P＜0.05)，16份雷公藤樣品抑制iNOS的作用顯著強(qiáng)于陽(yáng)性藥(P＜0.05)。
　　(4)譜-效相關(guān)分析:通過(guò)毒價(jià)與10種主要成分的簡(jiǎn)單相關(guān)分析，結(jié)果顯示:以相關(guān)系

10、數(shù)R＞0.80為指標(biāo)，可初步確定雷公藤紅素、雷公藤甲素、去甲基澤拉木醛三個(gè)成分可能是雷公藤毒性較強(qiáng)的成分，其中雷公藤紅素與毒價(jià)的相關(guān)性最高;通過(guò)10種主要成分與毒價(jià)的主成分回歸分析，擬合的回歸模型中，R2=0.745，且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.0049＜0.01。由回歸模型可知，變量雷公藤甲素具有較大的參數(shù)值，說(shuō)明雷公藤甲素可能對(duì)雷公藤的毒性有較大的貢獻(xiàn)度;綜合簡(jiǎn)單相關(guān)與多元回歸分析結(jié)果，初步認(rèn)為雷公藤紅素和雷公藤甲素可能對(duì)雷公藤毒性

11、具有較大的貢獻(xiàn)。通過(guò)抑炎因子IL-10與10種主要成分的簡(jiǎn)單相關(guān)分析，可初步確定10種主要成分與IL-10均無(wú)顯著相關(guān)性;通過(guò)10種主要成分與抑炎因子IL-10的主成分回歸分析，結(jié)果表明，擬合的回歸模型中，R2=0.4601，且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.0.0154＜0.05。由回歸模型可知，雷公藤甲素、雷公藤晉堿具有較大的參數(shù)值，說(shuō)明雷公藤甲素、雷公藤晉堿可能對(duì)雷公藤抗炎效應(yīng)有較大的貢獻(xiàn)度。
　　進(jìn)一步結(jié)合初步發(fā)現(xiàn)的藥效和毒性成

12、分對(duì)23批雷公藤樣品的毒價(jià)和效應(yīng)進(jìn)行綜合分析，篩選出“毒低效高”的樣品，包括5批雷公藤藥材，其基原均為雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.），其產(chǎn)地主要分布在西南地區(qū)。同時(shí)還篩選出“毒高效低”的樣品，包括源于安徽毫州及湖南岳陽(yáng)的2批雷公藤藥材。
　　結(jié)論：
　　所建體外生物檢測(cè)方法能有效評(píng)價(jià)雷公藤肝細(xì)胞毒性和體外抗炎效應(yīng)差異;譜-效相關(guān)分析研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素既可能是毒性成分，又可能是抗炎效應(yīng)成