高氮條件下microRNA528調(diào)控玉米倒伏的機(jī)制研究.pdf

1、為了獲得高產(chǎn)，農(nóng)民往往過量施用氮肥。氮肥的大量使用，不僅導(dǎo)致氮肥利用效率降低、環(huán)境污染等，還容易引起作物倒伏，但其中的機(jī)制有待于破解。實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)缺氮處理的玉米幼苗組成的小RNA文庫進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)ZmmiR528能夠響應(yīng)氮脅迫。miR528是特定單子葉植物所特有的，雖有研究表明miR528在水稻中通過作用于L-抗壞血酸氧化酶參與病原菌免疫反應(yīng)，但miR528在玉米中的靶基因與水稻明顯不同，暗示miR528在玉米中有不同功能。因此，本論文

2、通過分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)手段，深入研究miR528在玉米中的功能。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、通過硫代酸解法和乙酰溴法對(duì)不同氮處理?xiàng)l件下玉米苗期木質(zhì)素組成和含量進(jìn)行測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)在高氮條件下，地上部產(chǎn)生的p-香豆醇H、松柏醇G和芥子醇S單體減少，S/G比值降低，木質(zhì)素總含量降低;而在低氮條件下，產(chǎn)生的H、G和S單體增加，S/G比值升高，木質(zhì)素總含量增加。
　　2、Stem-loop RT-qPCR結(jié)果顯示，在高氮條件

3、下，ZmmiR528上調(diào)表達(dá)，而在低氮條件下，ZmmiR528下調(diào)表達(dá)，與木質(zhì)素對(duì)氮響應(yīng)恰好相反。
　　3、對(duì)ZmmiR528的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行定量，在不同氮處理?xiàng)l件下，我們發(fā)現(xiàn)ZmLAC3和ZmLAC5與ZmmiR528表達(dá)呈相反趨勢(shì)，暗示ZmLAC3和ZmLAC5可能是玉米ZmmiR528的真實(shí)靶基因，煙草瞬時(shí)表達(dá)和5'-RACE實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了此假設(shè)。
　　4、熒光定量結(jié)果顯示，ZmmiR528在玉米成熟期葉片中高度表達(dá)

4、，莖桿中度表達(dá)，根中表達(dá)量最低，而ZmLA C3表現(xiàn)出與ZmmiR528完全相反的表達(dá)趨勢(shì)。ZmmiR528和ZmLAC5原位雜交結(jié)果顯示，ZmmiR528主要在莖桿維管束的韌皮部表達(dá)，而ZmLAC5主要在維管束的纖維組織中表達(dá)，進(jìn)一步證明ZmmiR528對(duì)ZmLACs的負(fù)調(diào)控關(guān)系。
　　5、為進(jìn)一步研究ZmmiR528的功能，我們構(gòu)建了ZmmiR528的過表達(dá)及敲減轉(zhuǎn)基因玉米。在水培玉米苗期，ZmmiR528的表達(dá)量與木質(zhì)素含量

5、呈負(fù)相關(guān)。因此，我們對(duì)高氮條件下轉(zhuǎn)基因玉米成熟期的倒伏性進(jìn)行鑒定，與野生型及ZmmiR528敲減植株相比，ZmmiR528過表達(dá)植株更易倒伏，且莖桿穿刺力以及木質(zhì)素含量均降低，但纖維素和半纖維素含量未發(fā)生變化，這些結(jié)果表明高氮條件下ZmmiR528通過影響木質(zhì)素含量進(jìn)而影響玉米倒伏性。
　　6、我們同時(shí)也構(gòu)建了ZmmiR528的靶基因ZmLAC3的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因玉米，在高氮條件下，ZmLAC3OE植株莖桿穿刺力和木質(zhì)素含量增加了約1

6、0～20％，與ZmmiR528敲減植株表型一致。
　　7、野生型及ZmmiR528敲減玉米的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，ZmPAL7和ZmPAL8在ZmmiR528敲減玉米中發(fā)生差異表達(dá)。定量結(jié)果顯示，ZmPAL7和ZmPAL8在ZmmiR528過表達(dá)植株中下調(diào)表達(dá)，而在敲減植株中上調(diào)表達(dá)，這一結(jié)果在ZmLAC3OE植株中也得到證實(shí)。ZmPAL7和ZmPAL8也受氮水平調(diào)控，在低氮條件下上調(diào)表達(dá)。對(duì)其它ZmPALs進(jìn)行定量發(fā)現(xiàn)，ZmPAL