NFAT2對(duì)破骨細(xì)胞CAⅡ和V-ATPase基因表達(dá)的影響及低頻脈沖電磁場(chǎng)的干預(yù)研究.pdf

1、目的:研究低頻脈沖電磁場(chǎng)(PEMF)對(duì)去卵巢大鼠核因子κB受體活化因子(RANK)、活化T細(xì)胞核因子(NFATc1/NFAT2)、碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)、空泡型H+三磷酸腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)酶(Ⅴ-ATPase)基因表達(dá)的影響;研究NFAT2對(duì)CAⅡ和Ⅴ-ATPase基因表達(dá)的調(diào)控作用。
　　方法:1.選取48只雌性SD大鼠，分為三組，分別為SHAM（假手術(shù)）組、OVX（去卵巢）組、OVX+PEMF組，OVX+PEMF組隨機(jī)選一半被PEMF干預(yù)

2、14天和28天，測(cè)雌激素和骨密度。RT-PCR檢測(cè)NFAT2、RANK、CAⅡ和Ⅴ-ATPase基因的表達(dá)。
　　2.設(shè)計(jì)NFAT2-RNAi siRNA干擾序列，合成shRNA Oligo片段，將目的基因連接于干擾慢病毒骨架載體上。轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞STBL3，抽提陽性菌落并測(cè)序驗(yàn)證。將重組慢病毒載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，收集濃縮病毒上清液，利用熒光法測(cè)定病毒滴度。選擇干擾效率最高的慢病毒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.采

3、用4周齡SD大鼠提取骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)，誘導(dǎo)成破骨樣細(xì)胞(OLC)，加入不同干預(yù)，分為三組，分別為OLC對(duì)照組、VIVIT(NFAT2抑制劑)組、NFAT2iRNA慢病毒組，RT-PCR檢測(cè)NFAT2、CAⅡ和Ⅴ-ATPase基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.OVX組BMD和E2顯著低于SHAM組（P＜0.001），PEMF干預(yù)28天后，OVX+PEMF組BMD明顯高于OVX組（P＜0.01）;OVX+PEMF組中RANK和Ⅴ-

4、ATPase的表達(dá)均低于相應(yīng)OVX組;PEMF干預(yù)28天后，與OVX組對(duì)比，OVX+PEMF組CAⅡ和NFAT2基因表達(dá)顯著降低（P＜0.01)。
　　2.重組干擾慢病毒載體pL/shRNA/GFP-NFAT2序列經(jīng)鑒定，測(cè)序結(jié)果與Genebank中的基因序列比對(duì)顯示一致;干擾效率最高的慢病毒滴度為4×108TU/ml。
　　3.經(jīng)過不同干預(yù)后，VIVIT組和NFAT2iRNA慢病毒組的NFAT2、CAⅡ、Ⅴ-APase的基