鯊魚(yú)肝臟中與肝再生相關(guān)的microRNAs研究.pdf

1、條紋斑竹鯊，俗稱(chēng)狗鯊，屬于軟骨魚(yú)類(lèi)，在我國(guó)分布于南海、臺(tái)灣海峽和東海等海區(qū)，是南海最有代表性的軟骨魚(yú)類(lèi)之一。鯊魚(yú)肝臟占據(jù)內(nèi)臟重量的75％，研究表明，其具有較強(qiáng)的肝臟再生能力，體內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì)，許多研究者已從條紋斑竹鯊中分離克隆了多種與肝再生和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的刺激因子，但尚未有關(guān)其肝臟相關(guān)miRNA報(bào)道。近年研究表明，miRNA在動(dòng)物肝臟中含量豐富，在肝臟發(fā)育、癌變、再生階段發(fā)揮重要作用，因此，開(kāi)展條紋斑竹鯊肝臟中與肝再生相關(guān)的mi

2、RNA研究，鑒定與肝再生相關(guān)功能基因，將加深動(dòng)物的肝再生機(jī)理認(rèn)識(shí)，并且對(duì)推動(dòng)肝類(lèi)疾病及海洋生物學(xué)的研究工作具有積極意義。
　　 本研究通過(guò)條紋斑竹鯊肝臟2/3部分切除模型建立，獲得正常、再生6h、再生12h和再生24h肝組織;將正常和再生24h肝組織進(jìn)行miRNAIllumina測(cè)序，所得序列通過(guò)與斑馬魚(yú)(Danio rerio)、紅鰭東方鲀（Fugu rubripes）、青鳉（Oryzias latipes）、光滑爪蟾(Xen

3、opus laevis)、熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)、人（Homo sapiens）和小鼠(Mus musculus)的miRNA、miRNA前體序列(pre-miRNA)及米氏葉吻銀蛟（Callorhinchus milii）基因組序列進(jìn)行比對(duì)，首次鑒定出條紋斑竹鯊257條miRNA，包括91條已知miRNA和166條非保守的PC(Predicted Candidate)miRNA，其中正常肝組織135條PCmi

4、RNA，再生24h肝組織117條PCmiRNA，并且31條PCmiRNA只在再生24h肝組織檢測(cè)到，49條PCmiRNA只在正常肝組織檢測(cè)到;這些miRNA隸屬于34個(gè)基因簇，其中16個(gè)基因簇分別由16個(gè)共同的前體生成，每個(gè)前體生成2條miRNA;統(tǒng)計(jì)出已知miRNA在正常和再生24h肝組織中平均reads分別為8173和8972，PCmiRNA平均reads分別為1687和1781，但128條PCmiRNAreads＜10，116條m

5、iRNA在再生24h肝組織和正常肝組織中的log2reads比值大于1，但其中只有5條miRNAreads＞10，且只有8條為已知miRNA;對(duì)91條已知miRNA采用miRandav1.0b軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，86條miRNA可預(yù)測(cè)到靶基因，57條miRNA在其靶基因上有多個(gè)靶位點(diǎn)，共14163個(gè)靶位點(diǎn);將這些候選靶基因進(jìn)行GO分析，可映射到38個(gè)class，其中“cell proliferation”和“growth”條目各有5條靶

6、基因，相關(guān)的miRNA46條。
　　 通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證7條目標(biāo)miRNA于正常肝組織都有較高表達(dá)，并通過(guò)real-timePCR分析其中3條與細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)的miRNA（xtr-miR-125b、fru-miR-204a、hsa-miR-142-3p_R-1）在正常、再生6h、再生12h和再生24h肝組織4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)情況，得知3條miRNA在四個(gè)不同時(shí)間的轉(zhuǎn)錄情況存在較大差異，在肝再生6h、12h時(shí)表達(dá)顯著上調(diào)，

7、在24h時(shí)表達(dá)下降趨向于正常水平。為深入全面了解鯊魚(yú)肝再生與miRNA的關(guān)系，本研究還完成了6h和12h再生肝組織小RNA庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序，后期將繼續(xù)進(jìn)行miRNA的信息分析及差異驗(yàn)證工作。
　　 本研究還采用20條10堿基隨機(jī)引物和2條錨定引物對(duì)正常和再生24h肝組織通過(guò)DDRT-PCR方法進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，獲得10條差異序列;通過(guò)Blast檢測(cè)到其中3條與NCBIESTlibrary的序列有較高相似性，5條序列在再生肝組