雪上一枝蒿的體內(nèi)外毒性及減毒方法研究.pdf

1、雪上一枝蒿(Aconiti Brachypodi Radix)系毛莨科(Ranunculaceae)烏頭屬(Aconitum)植物短柄烏頭(Aconitum brachypoaum Diels)的藥用塊根，其化學(xué)成分主要為生物堿，具有消炎止痛，祛風(fēng)除濕的功效，臨床上主要用于治療神經(jīng)痛、風(fēng)濕痛、關(guān)節(jié)疼痛、創(chuàng)傷、骨折及手術(shù)后疼痛和晚期腫瘤疼痛等癥。由于雪上一枝蒿有劇毒，使用不當(dāng)容易中毒，而目前對雪上一枝蒿的毒性研究主要集中在其中毒機制上，但

2、對于解救其毒性的天然解毒劑、解毒機制研究的較少，因此對其進行深入的研究，將有助于尋找新的解毒藥物。
　　本實驗從尋找天然解毒劑著手對雪上一枝蒿神經(jīng)毒性的解毒方法和機制進行了深入研究，分別以黃芩苷、甘草次酸和金不換中提取的兩種單體混合物D1來解救雪上一枝蒿總生物堿所致的PC12細胞毒性，并研究其解毒機制；以金不換水提物來解救雪上一枝蒿所致小鼠急性毒性。以尋找天然解毒藥物為目標(biāo)，具有較高的理論和實踐意義。
　　本研究以PC12細

3、胞為研究對象，探討雪上一枝蒿總生物堿所致的細胞毒性及凋亡，以及對細胞內(nèi)鈣離子釋放、多巴胺(DA)和活性氧(ROS)的影響。采用MTT法，檢測不同濃度的雪上一枝蒿總生物堿對PC12細胞增殖的抑制作用以及同時或者提前兩小時孵育黃芩苷和甘草次酸對細胞的保護作用；JC-1熒光染色檢測線粒體膜電位，用熒光探針DCFH-DA測定細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，F(xiàn)lou-3/AM測定細胞內(nèi)鈣離子濃度。應(yīng)用多巴胺Elisa試劑盒檢測培養(yǎng)液上清DA的濃度。結(jié)

4、果表明：雪上一枝蒿總生物堿可顯著降低PC12細胞存活率，使細胞內(nèi)的ROS和鈣離子濃度顯著增高，并誘導(dǎo)細胞凋亡。而黃芩苷和甘草次酸通過清除細胞內(nèi)的ROS，降低鈣離子的釋放，降低對線粒體的損害，提高細胞的存活率，從而達到解毒的作用。說明雪上一枝蒿總生物堿通過釋放大量多巴胺引起多巴胺能神經(jīng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)從而導(dǎo)致線粒體功能紊亂，誘導(dǎo)細胞凋亡產(chǎn)生神經(jīng)毒性。
　　本課題組通過大量的文獻資料和實地考察，發(fā)現(xiàn)傈僳族、納西族人民常使用云南金不換來解

5、救雪上一枝蒿導(dǎo)致的毒性。因此我們以小鼠為研究對象，進行雪上一枝蒿總生物堿急性毒性實驗以及金不換水提物解救急毒實驗，觀察小鼠行為學(xué)變化及病理切片觀察組織病變狀況，使用代謝組技術(shù)分析致毒/解毒所致腦組織中代謝物變化。結(jié)果表明，給予不同劑量雪上一枝蒿總堿后，小鼠表現(xiàn)出各種中毒癥狀，包括干嘔、腹腔式呼吸、松毛、活動量減少輕微癥狀，也有抓嘴、出汗、流涎、便秘、眼球凸起的明顯中毒癥狀；25.6-78.13 mg/kg劑量組的急性死亡時間大部分在10

6、-30 min，死亡前先安靜后躁動，眼球凸起，抽搐死亡，表明為高毒性藥物。金不換水提物25-200 mg/kg劑量均不同程度緩解雪上一枝蒿總生物堿的中毒效應(yīng)，且死亡率下降，未死小鼠均在2-4 h內(nèi)恢復(fù)。病理結(jié)果顯示，雪上一枝蒿的毒性靶點主要是心、肝、腎等組織。腦組織未見明顯病變。代謝組分析顯示，空白組與中毒組動物代謝特征顯著不同。而解毒組在PC1方向則與空白組重合，說明其對雪上一枝蒿所致的毒性有解救作用。腦組織得分圖顯示，金不換水提物可

7、使代謝輪廓恢復(fù)到與空白組相似的趨勢。各組間主要代謝物表達水平表明，金不換水提物可適度調(diào)整雪上一枝蒿總生物堿染毒的腦組織代謝物水平。雪上一枝蒿染毒腦組織中?；撬犸@著增高。而且，腦組織中肌酸,肌醇,谷氨酸,乳酸,絲氨酸和脯氨酸也顯著升高。說明金不換水提物能夠明顯減少上述代謝物的升高。
　　在前期動物實驗研究工作基礎(chǔ)上。本研究又以PC12細胞為對象，初步探討金不換對雪上一枝蒿總生物堿所致的細胞神經(jīng)毒性的解救作用，對細胞釋放乳酸脫氫酶(L

8、DH)以及對Bcl-2表達水平的影響。采用MTT法，檢測金不換兩種單體混合物D1對細胞的保護作用；應(yīng)用LDH試劑盒檢測培養(yǎng)液上清中LDH漏出量。結(jié)果表明，金不換中提取的兩種單體的混合物D1可明顯增強雪上一枝蒿總生物堿損傷的PC12細胞活力，降低細胞LDH的含量，升高Bcl-2在細胞內(nèi)的表達，說明金不換可以降低由于雪上一枝蒿總堿引起的細胞凋亡，從而達到解雪上一枝蒿神經(jīng)毒的作用。其解毒作用與凋亡相關(guān)基因Bcl-2的改變有關(guān)。
　　結(jié)論

9、：雪上一枝蒿總生物堿所造成的神經(jīng)毒性可能是由于增加胞內(nèi)多巴胺的釋放，而大量多巴胺的釋放引起多巴胺能神經(jīng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)從而導(dǎo)致線粒體功能紊亂，誘導(dǎo)細胞凋亡從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。黃芩苷和甘草次酸通過清除細胞內(nèi)的ROS，降低鈣離子的釋放，降低對線粒體的損害，提高細胞的存活率，從而達到解毒的作用。金不換水提物可以明顯降低?；撬?、肌酸等代謝物在小鼠體內(nèi)的升高，緩解其中毒癥狀，從而達到解毒效果。金不換中提取的兩種單體混合物D1也可以降低由于總堿引起的細