腸道病毒71型滅活疫苗(人二倍體細(xì)胞)免疫后攻毒及未免疫攻毒恒河猴嬰猴丘腦組織的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、手足口病是由腸道病毒引起的一種急性傳染病。近年來,國(guó)內(nèi)報(bào)告的手足口病發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)均大幅度上升。在導(dǎo)致手足口病的20多種病毒中,由腸道病毒71型作為主要病原引起的手足口病發(fā)病病例數(shù)在總病例數(shù)中的比例在不斷上升。腸道病毒71型感染人體除了引起手足口病外,還可導(dǎo)致腦膜炎、腦炎、局部麻痹和急性遲緩性麻痹等神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及皰疹性咽峽炎等非神經(jīng)系統(tǒng)疾病,嚴(yán)重者能導(dǎo)致患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥或肺水腫等致死性的臨床后果。目前關(guān)于腸道病毒71型病毒的

2、研究主要集中在病原學(xué)、流行病學(xué)方面,其對(duì)人體的致病機(jī)理尚不是十分清楚。隨著腸道病毒71型引起的手足口病發(fā)病態(tài)勢(shì)不斷擴(kuò)大,而臨床上尚無公認(rèn)的特效治療藥物,因此研制一種安全有效的疫苗成為防治腸道病毒71型所致手足口病的最有效的預(yù)治措施。
　　 本研究采用初步研制成功的腸道病毒71型滅活疫苗,利用恒河猴嬰猴這一經(jīng)典動(dòng)物模型進(jìn)行了該疫苗的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。用疫苗免疫動(dòng)物后攻毒,疫苗免疫組恒河猴嬰猴神經(jīng)系統(tǒng)的各個(gè)部分均未檢出超過可信限的病毒HN

3、A陽(yáng)性結(jié)果,而感染對(duì)照組動(dòng)物各部位均檢測(cè)到明顯的病毒HNA陽(yáng)性結(jié)果。滅活疫苗能夠誘導(dǎo)免疫后的恒河猴嬰猴產(chǎn)生中和抗體,免疫后病毒攻擊后第7天恒河猴嬰猴血清中和抗體水平達(dá)1:512,能夠形成有效的抗病毒免疫保護(hù)效應(yīng)。免疫組化結(jié)果顯示,免疫動(dòng)物所誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫保護(hù)效應(yīng)能夠抑制病毒在體內(nèi)器官及組織中的增殖。結(jié)合攻毒后動(dòng)物相應(yīng)靶器官組織切片病理觀察,血清中和抗體檢測(cè)和免疫組化結(jié)果,分析表明:腸道病毒71型滅活疫苗免疫恒河猴嬰猴后,繼而以病毒攻擊,

4、將不會(huì)引起導(dǎo)致機(jī)體組織器官受損的病理學(xué)反應(yīng),疫苗具有保護(hù)性。
　　 此外,取上述研究對(duì)象中,免疫后攻毒和未免疫攻毒的恒河猴嬰猴中樞神經(jīng)系統(tǒng)的丘腦組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù):蛋白質(zhì)雙向電泳分離蛋白和專業(yè)軟件Imagemaster7.0進(jìn)行圖像分析,定量研究在病毒感染組及疫苗保護(hù)組中表達(dá)量有所差異的蛋白質(zhì)點(diǎn),通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜和蛋白信息數(shù)據(jù)庫(kù)建立差異蛋白質(zhì)譜。
　　 本研究共發(fā)現(xiàn)48個(gè)

5、表達(dá)量變化的蛋白,按功能分為7類:①、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白8個(gè),其中CFL2表達(dá)量變化結(jié)合功能分析提示該蛋白是研究EV71感染所致肌張力變化、心肌原纖維退化、心肌細(xì)胞凋亡潛在的靶點(diǎn)。結(jié)合各組PFN1、PFN2表達(dá)量變化與Profilins功能分析,提示在感染過程中PFN1、PFN2與細(xì)胞膜完整性或細(xì)胞內(nèi)吞作用相關(guān),疫苗的保護(hù)性降低了感染對(duì)細(xì)胞形態(tài)完整性的影響。②、小熱休克蛋白1個(gè),CRYAB,結(jié)合該蛋白在感染高峰期表達(dá)上調(diào)而與其它組不同的表

6、現(xiàn)及其在生理或者神經(jīng)變性疾病的壓力下能夠抑制中間纖維的聚集的能力,提示這種小熱休克蛋白與感染壓力下的細(xì)胞骨架穩(wěn)定性維持相關(guān)；③、生物大分子合成相關(guān)蛋白4個(gè),其中,CyPA作為一種具有調(diào)控免疫相關(guān)的因子,可能通過某種未知的信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活T細(xì)胞活化所需的細(xì)胞因子,而促進(jìn)T細(xì)胞的增殖,從而顯示感染高峰CyPA表達(dá)量與其它組的差異。NUTF2作為一種入核轉(zhuǎn)運(yùn)因子,其表達(dá)量變化提示其是感染狀態(tài)下宿主實(shí)現(xiàn)關(guān)閉或下調(diào)相關(guān)因子以抵抗病毒感染的可能途徑

7、之一。④、代謝相關(guān)蛋白13個(gè),這些蛋白含量變化提示感染狀態(tài)下的神經(jīng)細(xì)胞增殖周期的改變、神經(jīng)元發(fā)育的阻滯、突觸后神經(jīng)元的保護(hù)性抑制狀態(tài)改變等與EV71感染致病機(jī)理密切相關(guān),對(duì)疫苗組這些蛋白表達(dá)量的分析進(jìn)一步映證了疫苗的保護(hù)效應(yīng)。⑤、能量代謝與生物氧化相關(guān)蛋白11個(gè),提示病理狀態(tài)下和疫苗保護(hù)效應(yīng)下機(jī)體能量代謝系統(tǒng)和生物氧化途徑發(fā)生了改變。⑥、泛素-蛋白酶體途徑相關(guān)蛋白2個(gè),UCHL1和UBE2N在病毒感染組和疫苗保護(hù)組中的表達(dá)量差異及功能分

8、析也支持了滅活疫苗所誘導(dǎo)的免疫保護(hù)的有效性。⑦、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白9個(gè),PARK7表達(dá)變化提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)感染的具有保護(hù)性,且可能通過PARK7實(shí)現(xiàn)。蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)中共結(jié)合差異譜中表達(dá)量發(fā)生改變的蛋白的功能與免疫后攻毒和未免疫攻毒恒河猴嬰猴丘腦蛋白表達(dá)量變化分析,進(jìn)一步驗(yàn)證了滅活疫苗具有保護(hù)效應(yīng),發(fā)現(xiàn)了一些在感染中有重要意義的分子靶標(biāo),并為探討腸道病毒71型感染在疫苗免疫和非疫苗免疫機(jī)體中的宿主反應(yīng)的分子生物學(xué)特征,以及從這一水平上認(rèn)識(shí)