DCEF對炎癥微環(huán)境下rBMSCs成骨分化影響的研究.pdf

1、炎癥可導(dǎo)致自然牙及種植體周圍骨組織的吸收，抑制牙周膜或骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化成骨，影響骨質(zhì)的改建，是造成牙齒或種植體松動乃至脫落最主要的原因之一。如何改善炎癥影響下的BMSCs生物學(xué)性能是備受關(guān)注的焦點。
　　種植體骨結(jié)合過程的關(guān)鍵是BMSCs遷移至種植體-骨界面并且分化成骨。目前促進(jìn)種植體骨結(jié)合的方法有化學(xué)因素（包括化學(xué)因子及藥物等）、種植體

2、設(shè)計改性、組織工程、物理因素（包括超聲、微波、微電場等）。多種形式的外源性電場作為一種安全可靠的物理因素，其對骨形成及骨改建的促進(jìn)已被部分研究所證實。本課題組先前研究證實，直流微電場(Direct current electric field，DCEF)可促進(jìn)正常來源BMSCs遷移、增殖。DCEF對于炎癥微環(huán)境下BMSCs成骨分化能力影響的研究，目前鮮有報道。本研究利用外源性炎癥因子誘導(dǎo)大鼠BMSCs產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，加載DCEF，探究DC

3、EF對炎癥環(huán)境下的rBMSCs增殖及分化成骨能力的影響。為牙周炎癥及種植體周圍炎癥的治療提供新策略新依據(jù)。
　　實驗一 rBMSCs的提取、培養(yǎng)及鑒定
　　目的:分離提取目的細(xì)胞rBMSCs，傳至第三代，用作后續(xù)試驗。
　　方法:全骨髓貼壁培養(yǎng)法、成骨誘導(dǎo)茜素紅染色、成脂誘導(dǎo)油紅O染色及流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物。
　　結(jié)果:所獲P3代rBMSCs，表現(xiàn)出極強(qiáng)的增殖能力，形態(tài)比原代細(xì)胞更加均一穩(wěn)定，形態(tài)呈長梭狀

4、，成骨、成脂誘導(dǎo)后分別表現(xiàn)成骨及成脂能力;細(xì)胞表面標(biāo)志物CD105及CD90呈陽性，CD45及CD14呈陰性，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征。
　　結(jié)論:所提取的rBMSCs，純度高，具有成骨及成脂分化潛能，表現(xiàn)出間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特點，可滿足后續(xù)試驗的要求。
　　實驗二 不同濃度TNF-α誘導(dǎo)rBMSCs炎癥反應(yīng)的效果比較
　　目的:通過比較增殖抑制率及自身炎癥因子的表達(dá)水平，比較不同濃度的TNF-α誘導(dǎo)rBMSCs炎

5、癥反應(yīng)的效果，篩選出最適誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的濃度，為后續(xù)試驗提供穩(wěn)定、可靠的誘導(dǎo)方法。
　　方法:分別以6、8、10、12ng/mL濃度的TNF-α炎癥誘導(dǎo)、MTT法測細(xì)胞生長曲線、ELISA試劑盒測細(xì)胞TNF-α及IL-1β的分泌量及實時定量PCR測得各組細(xì)胞TNF-α及IL-1β基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果:當(dāng)TNF-α的濃度達(dá)到10ng/mL時，細(xì)胞增殖能力降低，大于12ng/mL時細(xì)胞生長緩慢，增殖能力明顯受到抑制，當(dāng)TNF-

6、α的濃度為10ng/mL時，細(xì)胞自身炎癥因子分泌量(TNF-α及IL-1β)及基因表達(dá)水平最高，表現(xiàn)出明顯的炎癥特性。
　　結(jié)論:不同濃度的TNF-α作用于rBMSCs，可使其在增殖能力、細(xì)胞自身炎癥因子的分泌量和基因的表達(dá)狀況上產(chǎn)生差異，可利用10ng/mL的TNF-α誘導(dǎo)rBMSCs產(chǎn)生炎癥反應(yīng)獲得炎癥環(huán)境下的rBMSCs。
　　實驗三 炎癥微環(huán)境對rBMSCs成骨分化能力的影響
　　目的:比較炎癥環(huán)境下的rBMS

7、Cs成骨分化能力的差異。
　　方法:炎癥誘導(dǎo)、成骨誘導(dǎo)茜素紅染色、鈣離子沉積量檢測、實時定量PCR檢測成骨基因BSP、OCN和Runx2表達(dá)量;Western blot檢測成骨蛋白ALP及Runx2的表達(dá)量。
　　結(jié)果:成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色結(jié)果顯示:炎癥微環(huán)境下的rBMSCs礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量低于正常rBMSCs;炎癥微環(huán)境下的rBMSCs成骨相關(guān)蛋白ALP及Runx2表達(dá)量顯著低于正常rBMSCs，成骨基因BSP、OCN和Ru

8、nx2表達(dá)量亦明顯降低
　　結(jié)論:體外構(gòu)建的炎癥微環(huán)境可抑制rBMSCs的成骨分化能力。
　　實驗四 探究DCEF對炎癥微環(huán)境下的rBMSCs增殖及成骨分化的影響
　　目的:探究最適DCEF對炎癥微環(huán)境下rBMSCs增殖及成骨相關(guān)蛋白及成骨相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。
　　方法:rBMSCs分為四組:H-rBMSCs、H+cytokines、H-rBMSCs+DCEF及H+cytokines+DCEF;MTT法測細(xì)胞

9、生長曲線;成骨誘導(dǎo)茜素紅染色;鈣離子沉積量檢測;實時定量PCR測成骨基因BSP、OCN和Runx2表達(dá)量;Western blot檢測成骨蛋白ALP及Runx2的表達(dá)量。
　　結(jié)果:茜素紅染色結(jié)果顯示:H+cytokines+DCEF組顏色深于H+cytokines組，淺于H-rBMSCs+DCEF組;加載電場組礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量明顯多于未加載電場組細(xì)胞(P＜0.05); H+cytokines+DCEF組BSP、OCN和Runx2基