富勒烯衍生物在不同培養(yǎng)環(huán)境下對小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響.pdf

1、目的:
　　探討抗氧化劑富勒烯衍生物富勒烯三酸(Fullerene Tris-Acid，F(xiàn)TA)和富勒醇(Fullerol)對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)成骨分化的影響
　　方法:
　　1.培養(yǎng)傳代小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)D1細(xì)胞系。
　　2.細(xì)胞處理:
　　第一部分:正常培養(yǎng)環(huán)境下，富勒烯衍生物對小鼠BMSCs成骨分化的

2、影響
　　以細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)+100μg/ml混合抗生素(青霉素/鏈霉素，P/S)作為空白對照組，在此基礎(chǔ)上添加10mM甘油磷酸鹽(β-GP)作為實驗對照組，在實驗對照組基礎(chǔ)上，添加不同濃度富勒烯衍生物FTA或富勒醇作為實驗組，F(xiàn)TA濃度梯度設(shè)置為0.25μM、0.5μM、1.0μM、2.0μM，富勒醇濃度梯度設(shè)置為0.33μM、1.1μM、3.3μM、10μM。
　　第二部分:外源性氧化刺激

3、培養(yǎng)環(huán)境下，富勒烯衍生物對小鼠BMSCs成骨分化的影響
　　以DMEM+FBS+P/S作為空白對照組，在此基礎(chǔ)上添加20mM雙氧水(H2O2)處理2小時作為實驗對照組，在實驗對照組基礎(chǔ)上，預(yù)先用不同濃度富勒烯衍生物FTA或富勒醇處理2小時作為實驗組。其中FTA濃度梯度設(shè)置為0.25μM、0.5μM、1.0μM、2.0μM，富勒醇濃度梯度設(shè)置為0.33μM、1.1μM、3.3μM、10μM。隨后各組更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM+F

4、B S+P/S+β-GP)持續(xù)培養(yǎng)。
　　第三部分:血清饑餓培養(yǎng)環(huán)境下，富勒烯衍生物對小鼠BMSCs成骨分化的影響
　　以DMEM+FBS+P/S作為空白對照組，在此基礎(chǔ)上去除FBS并過夜培養(yǎng)作為實驗對照組，在實驗對照組基礎(chǔ)上，預(yù)先用不同濃度富勒烯衍生物FTA或富勒醇處理2小時作為實驗組。其中FTA濃度梯度設(shè)置為0.25μM、0.5μM、1.0μM、2.0μM，富勒醇濃度梯度設(shè)置為0.33μM、1.1μM、3.3μM、10μ

5、M。隨后各組更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM+FB S+P/S+β-GP)持續(xù)培養(yǎng)。
　　3.檢測評估:
　　在細(xì)胞培養(yǎng)的不同時間，測定堿性磷酸酶(ALP)含量，并運(yùn)用茜素紅染色評估細(xì)胞礦化情況;通過乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒測定非正常培養(yǎng)環(huán)境對細(xì)胞的毒性;通過WST-1試劑盒測定細(xì)胞數(shù)量評估增殖情況;運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞凋亡及ROS水平;運(yùn)用蛋白免疫印跡(Western Blotting)技術(shù)，測定成骨分化標(biāo)志蛋白表達(dá)水

6、平，以及相關(guān)信號通路蛋白量。
　　結(jié)果:
　　1.正常成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)環(huán)境下:
　?、倥c實驗對照組相比，應(yīng)用FTA或富勒醇可提升ALP活性(P＜0.05），且均呈現(xiàn)濃度依賴性;②FTA可使BMSCs礦化結(jié)節(jié)量增加，在高濃度2.0μM時尤為明顯(P＜0.05），大體呈現(xiàn)濃度依賴性，富勒醇對細(xì)胞礦化程度并沒有明顯改變;③與未添加成骨誘導(dǎo)劑相比，成骨分化誘導(dǎo)環(huán)境下，ROS水平在第1天明顯升高，添加FTA可降低ROS水平;④與空白

7、對照組（未添加成骨誘導(dǎo)劑）相比，成骨誘導(dǎo)后Runx2、SOD2、p-JNK蛋白表達(dá)增加，p-Akt蛋白表達(dá)減少，在成骨誘導(dǎo)劑基礎(chǔ)上分別添加FTA或富勒醇后，Runx2、p-JNK、p-Akt蛋白水平均有提升，且在FTA較低濃度時作用更為明顯。
　　2.外源性氧化刺激培養(yǎng)環(huán)境下:
　?、俳?jīng)FTA處理后，BMSCs礦化結(jié)節(jié)均明顯增加(p＜0.05），在中低濃度0.25μM、0.5μM時更為顯著;富勒醇處理對細(xì)胞礦化程度并沒有明顯

8、改變;②FTA和富勒醇處理后與為未經(jīng)處理相比，細(xì)胞ALP活性差異不顯著;③與空白對照組(未加入H2O2)相比，經(jīng)H2O2處理后細(xì)胞增殖數(shù)量明顯減少，添加FTA處理后，細(xì)胞增殖數(shù)量較未添加組明顯增加(P＜0.05），而富勒醇對此并無明顯作用;④經(jīng)H2O2處理后細(xì)胞死亡率明顯增加，F(xiàn)TA在低濃度下可降低細(xì)胞死亡率，而富勒醇這一作用在其高濃度時（大于1.1μM）更為明顯，同時凋亡測定結(jié)果提示這種氧化刺激所引起的死亡可能與凋亡有關(guān);⑤與空白對照

9、組(未添加H2O2)相比，氧化刺激可使上調(diào)p-Akt、SOD2、FoxO1等蛋白表達(dá)，在FTA或富勒醇作用下，其表達(dá)進(jìn)一步增加。對于成骨標(biāo)志物Runx2含量，各實驗組結(jié)果差異不大。
　　3.血清饑餓培養(yǎng)環(huán)境下:
　　流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞PI染色情況和凋亡蛋白Fas水平結(jié)果顯示，F(xiàn)TA和富勒醇均能有效抑制血清饑餓所引起的細(xì)胞凋亡。礦化測定及細(xì)胞增殖、毒性結(jié)果顯示，應(yīng)用FTA或富勒醇與實驗對照組相比沒有明顯差別。
　　結(jié)論