牛分枝桿菌感染THP--1細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析及PMN在宿主應(yīng)答其感染過程中的功能探索.pdf

1、結(jié)核病(tuberculosis，TB)主要是經(jīng)呼吸道吸入結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）和牛結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）的氣溶膠而引起的人畜共患傳染病。M.bovis能夠感染包括人和牛在內(nèi)的多個(gè)宿主，并且能在牛和人之間廣泛傳播，從而嚴(yán)重危害著食品安全和公共衛(wèi)生健康。全球大約三分之一的人感染了M.tb并長(zhǎng)期處于潛伏性感染狀態(tài)(Latent TB in

2、fection，LTBI)。然而LTBI患者缺乏典型的結(jié)核病臨床病理特征，大約有5％～10％的LTBI患者中會(huì)發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核病，一旦感染了人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）后LTBI患者結(jié)核病的發(fā)病率將提高21～34倍。目前，唯獨(dú)被批準(zhǔn)用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗為卡介苗(Bacille Calmette-Gue'rin，BCG)，其是人工體外培養(yǎng)M.bovis連續(xù)傳代所得的減毒活疫苗。但卡介

3、苗對(duì)成人肺結(jié)核患者免疫保護(hù)力約為60％，并且在免疫缺陷的接種人群中容易發(fā)展為散播性卡介苗(Disseminated BCG)。骨髓源細(xì)胞表達(dá)的觸發(fā)受體(Triggering receptor expressed on myeloid cells，TREM)，通過調(diào)控Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)誘導(dǎo)的信號(hào)而調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)，并因此在微調(diào)炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TREM1在傳染性急性炎癥疾病中具有診斷

4、前景，包括結(jié)核胸膜肺炎;并且在非傳染性炎癥疾病及癌癥中有治療前景，例如動(dòng)脈粥樣硬化。目前，全球結(jié)核病面臨的挑戰(zhàn)包括:對(duì)M.bovis感染人致病的傳播機(jī)制缺乏認(rèn)識(shí)，BCG對(duì)肺結(jié)核患者保護(hù)力低下的機(jī)制仍然并不清楚，而且對(duì)潛伏性結(jié)核患者缺乏有效診斷方法和治療手段。
　　因此本課題通過同位素標(biāo)記相對(duì)與絕對(duì)定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術(shù)分析了兩

5、種強(qiáng)毒性分枝桿菌復(fù)合體（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）菌株，包括M.tb-H37Rv和M.bovis，以及疫苗菌株BCG感染的人巨噬細(xì)胞（Human monocytes，THP-1）的差異蛋白質(zhì)組。探討了強(qiáng)毒株M.bovis感染人細(xì)胞過程中，潛在的免疫應(yīng)答和傳播機(jī)制。并以減毒疫苗株BCG感染小鼠，解析宿主的免疫應(yīng)答過程和宿主細(xì)胞殺傷BCG的機(jī)制。接著以TREM1基因缺失小鼠作為動(dòng)物模型，

6、探討TREM1介導(dǎo)的BCG感染宿主后差異應(yīng)答反應(yīng)。進(jìn)一步揭示了，BCG誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答及肺外結(jié)核病發(fā)展的分子機(jī)制。并且利用溫敏性噬菌體轉(zhuǎn)染的方法，高效而快速的獲取phoP、Rv1759c和LprG等相關(guān)基因的缺失株。在獲取結(jié)核分枝桿菌基因缺失菌株的基礎(chǔ)上，探索相關(guān)基因與細(xì)胞及小鼠互作過程中的差異反應(yīng)。通過病原菌基因改造、免疫調(diào)節(jié)和藥物調(diào)控三方面并從病原與宿主互作的過程開展研究，為結(jié)核病的防治提供新思路。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1

7、.強(qiáng)弱毒株感染人巨噬細(xì)胞差異蛋白組學(xué)分析
　　成功獲得MTBC強(qiáng)弱毒株感染THP-1細(xì)胞的差異蛋白表達(dá)譜，特別是牛源強(qiáng)毒株M.bovis誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞蛋白質(zhì)改變。共同鑒定了2032個(gè)蛋白質(zhì)，其中61個(gè)具有顯著性差異。利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)毒株誘導(dǎo)的差異蛋白最顯著的是吞噬體成熟通路和TNF信號(hào)通路，所涉及差異蛋白包括IFIT1、IFIT3、CCL20和ICAM1。61個(gè)差

8、異蛋白中31個(gè)參與囊泡運(yùn)輸，由強(qiáng)毒株誘導(dǎo)的五個(gè)共同的差異蛋白包括NCF1和ICAM1，彼此相互作用且涉及免疫相關(guān)的信號(hào)通路，如白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移通路。BCG與H37Rv誘導(dǎo)THP-1不同的吞噬體成熟通路。不同毒力的分枝桿菌菌株感染巨噬細(xì)胞后，都能誘導(dǎo)大量差異顯著的炎性細(xì)胞因子上調(diào)表達(dá)，但M.bovis誘導(dǎo)細(xì)胞IL-4表達(dá)水平顯著性下調(diào)。溶酶體適配器蛋白LAMTOR2可能是牛分枝桿菌胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)臐撛诎袠?biāo)。揭示由M.bovis感染獨(dú)特地

9、誘導(dǎo)的MTHFD2，VPS26A和TBC1D9B蛋白，為結(jié)核病由牛到人的宿主傳播靶點(diǎn)和新的生物診斷標(biāo)識(shí)物。
　　2.PMN在宿主應(yīng)答B(yǎng)CG感染過程中的功能探索
　　C57BL/6小鼠經(jīng)呼吸道滴鼻方式感染BCG后，經(jīng)流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)宿主通過中性粒細(xì)胞(Neutrophils，PMN)殺傷BCG，并且發(fā)現(xiàn)組織臟器存在不同程度的病理損傷。隨著感染時(shí)間的推移，小鼠肺部的BCG逐漸被清除，在感染28天肺部檢測(cè)不到BCG。經(jīng)不同的感染途

10、徑，TREM1-/-小鼠所產(chǎn)生的病理損傷程度不相同，宿主免疫應(yīng)答過程也存在差別。經(jīng)呼吸道滴鼻方式感染BCG相比于尾靜脈注射感染方式，TREM1-/-小鼠能產(chǎn)生更嚴(yán)重水平的肺部損傷和體重下降，并且伴隨著肺臟、脾臟質(zhì)量增加，及在感染7天肺組織能夠分離出BCG。不同的感染途徑，免疫組化分析TREM1-/-小鼠脾臟和肺臟組織均能產(chǎn)生高水平的PMN，但是對(duì)病原菌在肺部的殺傷能力不同。經(jīng)尾靜脈注射BCG感染后50天，施用免疫抑制劑地塞米松藥物處理2

11、周，TREM1-/-小鼠存活時(shí)間延長(zhǎng)。通過尾靜脈注射人源強(qiáng)毒株H37Rv后，TREM1-/-小鼠能夠產(chǎn)生差異顯著的IL-1β與IL-12。綜上說明，宿主通過PMN能夠有效的殺傷BCG，但是缺乏TREM1后肺部殺傷能力減弱。TREM1與PMN可能是結(jié)核分枝桿菌感染過程中，銜接宿主天然免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的紐帶。而TREM1抑制劑與地塞米松可能為未來臨床肺外結(jié)核病患者治療提供新的思路。
　　3.H37RvΔphoPΔRv1759cΔL

12、prG基因缺失菌株的構(gòu)建
　　利用噬菌體轉(zhuǎn)染通過同源重組，成功構(gòu)建了H37RvΔphoPΔRv1759cΔLprG及M.bovisΔphoPΔLprG缺失菌株。通過菌落形態(tài)試驗(yàn)肉眼觀察，H37RvΔphoP與H37RvΔphoPΔRv175cΔLprG的嵴狀蜿蜒程度與親本菌株相比減弱，特別是H37RvΔphoP。接著進(jìn)行了細(xì)胞與小鼠感染，H37RvΔphoPΔRv175cΔLprG缺失對(duì)菌株入侵巨噬細(xì)胞的能力顯著性降低，且能誘導(dǎo)細(xì)