Tenascin--C在急性心肌梗死早期診斷、預(yù)后評(píng)估及心肌修復(fù)中的作用研究.pdf

1、背景:
　　急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的發(fā)病率越來(lái)越高，嚴(yán)重威脅著人類健康，給全世界帶來(lái)了沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　對(duì)AMI的早期診斷和預(yù)后評(píng)估仍然是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。冠心病是一個(gè)綜合征，即從動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)到終末期心臟病的持續(xù)過(guò)程。在這一過(guò)程中，炎癥免疫反應(yīng)參與從初始到終末期的全過(guò)程。而Tenascin-C作為參與炎癥免疫反應(yīng)的一

2、員，在冠心病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Tenascin-C是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的一種具有獨(dú)特六聚體結(jié)構(gòu)的糖蛋白，在心臟發(fā)育階段大量表達(dá)，但在健康成年人幾乎不表達(dá)，而在AMI、心肌冬眠、心肌炎、擴(kuò)張型心肌病等病理狀態(tài)時(shí)再次大量表達(dá)。這就提示Tenascin-C在心血管病的進(jìn)展中發(fā)揮作用。
　　已有研究發(fā)現(xiàn)，Tenascin-C在擴(kuò)張型心肌病、主動(dòng)脈夾層、風(fēng)濕性心臟病等心血管疾病中

3、具有重要作用，可能成為這些疾病診斷及預(yù)后的新型標(biāo)志物。Tenascin-C可以促進(jìn)AS進(jìn)展，而急性ST段抬高性心肌梗死(ST segment elevation myocardial infarction，STEMI)作為AS進(jìn)展、斑塊由穩(wěn)定變?yōu)椴环€(wěn)定的極端狀態(tài)，那么Tenascin-C在STEMI早期診斷和預(yù)后評(píng)估方面是否起作用？本課題將在第一部分加以探討。
　　目前AMI的常規(guī)治療方法，包括藥物治療、介入治療及外科手術(shù)治療等，

4、都沒(méi)有解決心肌細(xì)胞丟失的關(guān)鍵問(wèn)題，因此無(wú)法完全防止或逆轉(zhuǎn)這種病理學(xué)過(guò)程，最終會(huì)導(dǎo)致心臟重塑和心力衰竭的發(fā)生。近年來(lái)在這一領(lǐng)域取得的一個(gè)突破性進(jìn)展就是干細(xì)胞移植在AMI中的應(yīng)用。礎(chǔ)研究多數(shù)證實(shí)干細(xì)胞移植有效，但臨床研究發(fā)現(xiàn)心臟功能改善并不顯著。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)移植后歸巢至梗死區(qū)域局部的干細(xì)胞數(shù)量較少，并且分化和生存率較低，這明顯影響了干細(xì)胞移植治療的效果。上述問(wèn)題的存在，促使人們?cè)贏MI的干細(xì)胞治療領(lǐng)域不斷進(jìn)行新的探索，以期改善治

5、療效果。
　　自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)取材方便，不存在倫理問(wèn)題及免疫排斥反應(yīng)問(wèn)題，可能成為現(xiàn)有條件下用于AMI治療的最佳細(xì)胞選擇之一。Tenascin-C作為炎癥免疫指標(biāo)，除了可以作為STEMI早期診斷和預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物外，其本身還具有促進(jìn)多種細(xì)胞粘附、遷移及分化表達(dá)等作用。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Tenascin-C對(duì)BMMSC有保護(hù)作用及促進(jìn)遷移的作

6、用。本課題第二部分將構(gòu)建AMI小鼠模型，探討Tenascin-C在小鼠AMI后BMMSC移植治療中的作用及機(jī)制，為改善AMI后心肌修復(fù)的療效提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。
　　第一部分 Tenasc in-C在急性ST段抬高性心肌梗死患者早期診斷及預(yù)后評(píng)估中的作用研究
　　目的:
　　探討Tenascin-C在STEMI患者早期診斷及預(yù)后評(píng)估中的作用。
　　方法:
　　選擇2015年6月至2016年7月大連醫(yī)

7、科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科收治的成功行急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)的STEMI患者113例作為研究對(duì)象。并選擇同期住院經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影排除冠心病診斷的患者22例作為對(duì)照組。43例STEMI患者在發(fā)病第1、2、3、5、7天抽取靜脈血，測(cè)定血清Tenascin-C水平，確定其隨時(shí)間變化的規(guī)律。其余的患者在發(fā)病第3天抽取靜脈血，測(cè)定血清Tenascin-C水平。應(yīng)用ELI

8、SA方法檢測(cè)Tenascin-C、TC、TG、HDL-C、LDL-C、hs-CRP、cTnI、BNP等指標(biāo)。應(yīng)用GE或飛利浦公司生產(chǎn)的DSA機(jī)器進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影及介入治療。應(yīng)用GE Vivid7超聲心動(dòng)圖儀檢測(cè)患者的心功能。所有STEMI患者隨訪12個(gè)月，觀察主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACE)發(fā)生情況。使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M

9、±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩之間比較采用LSD法;計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用X2檢驗(yàn)。采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。應(yīng)用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，簡(jiǎn)稱ROC曲線）分析確定血清Tenascin-C水平預(yù)測(cè)STEMI患者M(jìn)ACE發(fā)生的最佳閾值點(diǎn)。MACE發(fā)生率采用log-rank檢驗(yàn)及Kaplan-Meie

10、r生存分析，并采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析預(yù)測(cè)12個(gè)月MACE發(fā)生的危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.STEMI患者血清Tenascin-C水平變化規(guī)律:43例STEMI患者發(fā)病后第1、2、3、5、7天的血清Tenascin-C水平依次為(46.51±24.37)ng/ml、（66.87±34.44）ng/ml、(97.49±41.24)ng/ml、（86.89±38.06)ng/ml、（70

11、.87±34.86)ng/ml。血清Tenascin-C在發(fā)病后第1天內(nèi)開(kāi)始升高，第3天達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。
　　2.STEMI患者Tenascin-C水平與hs-CRP、cTnI、BNP等因素呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.000、0.000、0.003（均有P＜0.05）;與eGFR呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.002(P＜0.05)。
　　3.12個(gè)月隨訪結(jié)果:113例STEMI患者在12個(gè)月的隨訪中，失訪0人，共有31例

12、患者發(fā)MACE，其中心源性死亡6例(5.3％)、心力衰竭（心力衰竭加重）18例(15.9％)、再發(fā)心肌梗死7例(6.2％)。
　　結(jié)論:
　　檢測(cè)血清Tenascin-C水平有助于早期識(shí)別和診斷AMI。STEMI患者血清Tenascin-C水平與hs-CRP、cTnI、BNP及eGFR等因素相關(guān)，對(duì)MACE的發(fā)生具有很好的預(yù)測(cè)價(jià)值，是STEMI患者12個(gè)月發(fā)生MACE的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。
　　第二部分 Tenascin-C

13、在急性心肌梗死小鼠心肌修復(fù)中的作用和機(jī)制研究
　　目的:
　　探討Tenascin-C在AMI小鼠BMMSC移植治療中的作用及機(jī)制。
　　方法:
　　選擇C57BL/6小鼠進(jìn)行BMMSC分離、培養(yǎng)、傳代。通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)C57BL/6小鼠BMMSC進(jìn)行鑒定。制備AMI小鼠模型，并應(yīng)用超聲心動(dòng)圖及病理學(xué)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。應(yīng)用VEVO1100小動(dòng)物超聲系統(tǒng)檢測(cè)AMI小鼠的心功能，評(píng)價(jià)BMMSC移植及Tenascin-C處

14、理對(duì)AMI小鼠心功能的影響。應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro plus)測(cè)量并計(jì)算梗死心肌面積。ELISA法測(cè)定AMI小鼠血漿中TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-12等炎癥因子的水平，評(píng)價(jià)BMMSC移植及Tenascin-C處理對(duì)AMI小鼠炎癥因子的影響。將GFP標(biāo)記的BMMSC注射至AMI小鼠體內(nèi)，1周后取心臟作冰凍切片，放至熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞歸巢情況。采用SPSS19.0軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以

15、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間心功能、梗死心肌面積、炎癥因子水平、細(xì)胞歸巢情況等均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩之間比較采用LSD法。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間存活率比較采用X2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示，CD29+(96.9％)、CD34+(96.3％)、CD44+(40.9％)、CD45-(0.7％)，符合小鼠B

16、MMSC表面抗原特點(diǎn)。
　　2.心梗組小鼠結(jié)扎部位心肌變薄，局部運(yùn)動(dòng)減弱，病理學(xué)證實(shí)局部發(fā)生纖維化;超聲心動(dòng)圖檢查證實(shí)，心梗組小鼠心功能較對(duì)照組明顯減低(P＜0.05)。AMI小鼠模型成功建立。
　　3.BMMSC移植組小鼠的心功能優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)，Tenascin-C處理組小鼠心功能進(jìn)一步改善(P＜0.05)。
　　4.BMMSC移植組小鼠的梗死心肌面積較對(duì)照組減少(P＜0.05)，Tenascin-C處理

17、組小鼠梗死心肌面積進(jìn)一步減少(P＜0.05)。
　　5.BMMSC移植組小鼠的TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-12等炎癥因子的水平較對(duì)照組降低(P＜0.05)，Tenascin-C處理組小鼠上述炎癥因子的水平進(jìn)一步降低(P＜0.05)。
　　6.GFP標(biāo)記的BMMSCs移植組小鼠的梗死心肌區(qū)域可以見(jiàn)到BMMSC歸巢，Tenascin-C處理組小鼠的BMMSC的歸巢率增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論: