納米孔檢測系統(tǒng)的研制及其在單分子檢測中的應(yīng)用.pdf

1、納米孔傳感檢測技術(shù)自1996年一經(jīng)提出就被證實(shí)是一種強(qiáng)有力的快速非標(biāo)記單分子檢測的技術(shù)。由于該技術(shù)有著高靈敏、快速、非標(biāo)記識別DNA分子中四種堿基的潛能，納米孔有望開辟一種新的無需擴(kuò)增和標(biāo)記的DNA測序技術(shù)，被認(rèn)為是最有可能實(shí)現(xiàn)將DNA測序成本降至100美元的技術(shù)之一。目前，除了核酸，蛋白質(zhì)等生物多聚物之外，納米孔檢測技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于納米顆粒、病毒顆粒的尺寸和表面理化性質(zhì)的表征。這些研究結(jié)果使得科學(xué)家們更加堅(jiān)信，納米孔作為單分子檢測技

2、術(shù)的一個(gè)平臺，必將發(fā)展成為一種低成本的測序方法以及高靈敏的生物傳感檢測技術(shù)。
　　在納米孔單分子DNA測序應(yīng)用中，由于DNA分子存在在隨機(jī)的折疊或螺旋卷曲，在其通過納米孔時(shí)會對檢測的電流信號產(chǎn)生影響。目前還缺乏一種行之有效的方法和理論來理解螺旋卷曲的DNA分子在通過納米孔時(shí)的動態(tài)學(xué)行為以及其對電流信號產(chǎn)生的影響，所得信號的阻塞電流及過孔持續(xù)時(shí)間分布都顯現(xiàn)出復(fù)查的非高斯型分布，從而很難通過單一電流信號去識別DNA序列信息及高靈敏的傳

3、感檢測。本課題著眼于提高固態(tài)納米孔的檢測精度，先后探索了DNA分子、納米材料以及剛性桿狀病毒顆粒通過固態(tài)納米孔的信號特征及規(guī)律。通過研究λ-DNA的信號特征，證實(shí)DNA分子的折疊和螺旋結(jié)構(gòu)會對信號產(chǎn)生不確定的影響。為更好地理解和分析DNA分子通過納米孔的動態(tài)學(xué)行為，本課題從結(jié)構(gòu)單元出發(fā)，通過研究球形金納米顆粒(AuNPs)、剛性桿狀煙草花葉病毒(TMV)通過固態(tài)納米孔的信號特征，闡述分析物的幾何形狀、尺寸、表面電荷、柔性等對其通過納米孔

4、時(shí)的動態(tài)行為及相應(yīng)的電流信號的影響，以期望找到影響其相應(yīng)檢測精度的主要因素，為固態(tài)納米孔更精確的應(yīng)用于DNA測序、納米材料以病毒顆粒的傳感檢測提供理論指導(dǎo)。
　　1、納米孔的檢測系統(tǒng)的構(gòu)建
　　本課題在基于國際上常用的膜片鉗電流放大器作為電流放大和檢測設(shè)備，結(jié)合其相應(yīng)的數(shù)據(jù)采集卡1440A作為數(shù)據(jù)的采集設(shè)備，研究納米孔傳感檢測系統(tǒng)中各組成部分的連接及相互工作方式，確定了一套完整而有效的電磁屏蔽方法。同時(shí)，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需要，設(shè)

5、計(jì)并制作了合理而簡便的納米孔檢測流體裝置，既能滿足操作簡便的要求，又能最大程度的減少實(shí)驗(yàn)所需試劑量及噪聲。
　　2、λ-DNA分子通過納米孔的信號檢測及分析
　　首次利用FIB制備的尖端30nm尾端60 nm的錐形納米孔研究λ-DNA在200至450 mV下通過該孔時(shí)的信號特征及規(guī)律，建立一套完整的數(shù)據(jù)提取和分析方法。系統(tǒng)地研究了λ-DNA通過該納米孔的阻塞電流、過孔持續(xù)時(shí)間以及過孔事件頻率與電壓的相互關(guān)系。成功地檢測了λ-

6、DNA的過孔信號及其構(gòu)象。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)增加電壓可以顯著地提高事件頻率以及拉伸超螺旋的DNA分子。相較于6-30 nm的超薄納米孔，我們也發(fā)現(xiàn)λ-DNA通過該孔存在一個(gè)181 mV的閾值電壓，這與孔的形狀和厚度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中λ-DNA的速度減慢了5倍，而捕獲半徑擴(kuò)大了兩倍。其結(jié)果表明大孔徑且長的錐形納米孔不僅穩(wěn)定性更高，檢測通量大，并且其檢測精度依然較高。然而我們也發(fā)現(xiàn)λ-DNA通過納米孔時(shí)存在隨機(jī)的折疊，使得我們測得的阻塞電流呈現(xiàn)出多水

7、平，同時(shí)其過孔速度也成非線性狀態(tài)。為了更好理解DNA通過納米孔的動態(tài)學(xué)行為，由于DNA局部(50 nm)可以視為剛性的桿，而整體視為柔性的線，因此將一條長鏈DNA視為由球連接多個(gè)短的剛性桿是一種簡單而有效模擬DNA的方法?；诖?，我們后續(xù)采用結(jié)構(gòu)簡單的金納米顆粒和桿狀病毒，系統(tǒng)地研究其分析物的形狀與柔性對其通過納米孔的動力學(xué)過程的影響。
　　3、金納米顆粒以及與DNA分子結(jié)合體通過納米孔的信號檢測及分析
　　本實(shí)驗(yàn)中，我們首

8、次報(bào)道到了AuNPs-DNA結(jié)合體在低鹽和0.5 M KCl溶液下通過60 nm的納米孔時(shí)分別產(chǎn)生了雙階事件以及非對稱的拖尾事件。我們發(fā)現(xiàn)AuNPs-DNA結(jié)合體該孔時(shí)產(chǎn)生了一個(gè)電場依賴性的電導(dǎo)變化以及一個(gè)非線性電泳現(xiàn)象;同時(shí)在低鹽溶液中所產(chǎn)生的電導(dǎo)變化的相對誤差也較高鹽溶液要小。因此，我們基于電場誘導(dǎo)電荷及AuNPs上結(jié)合的DNA的結(jié)構(gòu)的變化研究并解釋了雙階事件以及非對稱的拖尾事件形成的原因。進(jìn)一步我們根據(jù)非線性電泳推導(dǎo)出了納米顆粒通

9、過納米孔所引起的電導(dǎo)變化的近似計(jì)算公式，而后系統(tǒng)地研究了鹽離子濃度、施加的電壓以及顆粒的尺寸大小對納米孔電導(dǎo)變化的影響。本研究結(jié)果表明固態(tài)納米孔不僅可以用于納米顆粒的尺寸表征，還可以成為一種更簡單而有力的研究和觀察單個(gè)納米顆粒非線性電泳的平臺。這一研究將為用金納米顆粒一分析物檢測技術(shù)與納米孔檢測的聯(lián)合來檢測目的片段或分析物提供有價(jià)值的建議，并且為納米孔用以表征納米顆粒的表面性質(zhì)打開了新的一扇門。
　　4、煙草花葉病毒通過納米孔的信

10、號檢測及分析
　　首次實(shí)現(xiàn)將剛性的桿狀植物病毒(TMV)通過不同的孔徑的氮化硅納米孔。有趣的是，由于TMV的剛性很強(qiáng)，我們觀察到了三類TMV通過納米孔事件，其次我們發(fā)現(xiàn)在TMV過孔事件平臺期中存在著一個(gè)很強(qiáng)的電流的波動。由此我們結(jié)合粗?；睦手f動態(tài)模擬（coarse-grained Langevin Dynamics）提出了TMV通過固態(tài)納米孔的動力學(xué)模型?；谶@一模型，我們可以通過其過孔事件的電流特性推測其過孔時(shí)相應(yīng)的行為。隨

11、后我們系統(tǒng)的研究了TMV在孔外尋找入口時(shí)的孔外阻塞接觸電導(dǎo)△Gacc、TMV豎直過孔的阻塞電導(dǎo)△G0以及TMV旋轉(zhuǎn)對電導(dǎo)變化的影響，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)孔徑依賴性的△Gacc及電導(dǎo)波動范圍。最后，我們研究了TMV在通過納米孔的過程中的旋轉(zhuǎn)頻率，其結(jié)果表明TMV在過孔的時(shí)候有旋轉(zhuǎn)成平行電場的趨勢。本課題的研究將會給檢測桿狀病毒以及研究納米孔過孔行為的動態(tài)學(xué)帶來新的啟示;結(jié)合之前的DNA以及半剛性半柔性的fd病毒，本課題也提出了一種新型的用納米孔來檢