間尼索地平的質(zhì)量控制和體內(nèi)外代謝研究.pdf

1、間尼索地平(m-nisoldipine)[化學(xué)名稱：1，4-二氫-2，6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-3，5-吡啶二羧酸甲酯異丁酯]是河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院首次合成的一種新的二氫吡啶類鈣拮抗劑。間尼索地平與尼索地平(nisoldipine)為同分異構(gòu)體，尼索地平用于防治冠心病、高血壓和慢性充血性心衰及心源性休克，療效顯著，但是對(duì)光不穩(wěn)定，通過結(jié)構(gòu)改造，間尼索地平不僅保留了尼索地平的藥理作用，而且光穩(wěn)定性也明顯增。目前，間尼索地平的含量測(cè)定

2、方法主要有鈰量法，紫外分光光度法以及高效液相色譜法等。本研究首次采用氣相色譜法(GC)，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法，以尼莫地平(nimodipine)為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定了間尼索地平原料藥的含量。 藥物代謝研究在新藥研發(fā)中占有很重要的地位，它可以使我們預(yù)知候選的新藥化合物在體內(nèi)可能的代謝物及其潛在的毒性，另一方面可以使我們預(yù)知在體外有效的藥物是否在體內(nèi)同樣有效，因?yàn)樵S多在體外有效的藥物在體內(nèi)療效很差或無效，這主要是由于這些化合物

3、在體內(nèi)的吸收和代謝轉(zhuǎn)運(yùn)等方面的原因所造成的。因此，這一工作可為新藥在體內(nèi)的代謝過程和毒性評(píng)價(jià)提供重要的依據(jù)，同時(shí)根據(jù)其代謝物的生物活性和毒性，可以合成更為安全有效的候選化合物。 本文從體外到體內(nèi)兩個(gè)方向?qū)﹂g尼索地平的代謝進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)代謝物。通過微生物轉(zhuǎn)化方法得到一轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的純品，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確認(rèn)。對(duì)間尼索地平在大鼠體內(nèi)的代謝途徑有了一定的推斷。第一部分GC與GC-MS法測(cè)定間尼索地平含量目的：建立GC和GC-MS

4、法測(cè)定間尼索地平原料藥含量的方法，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。 方法：1.GC法：(1)確定色譜條件：選擇毛細(xì)管色譜柱，優(yōu)化儀器參數(shù)，如進(jìn)樣口溫度、柱溫、檢測(cè)器溫度等，調(diào)整流動(dòng)相流速，確定分析條件。(2)進(jìn)行方法學(xué)考察，測(cè)定樣品。2.GC-MS法：(1)確定色譜條件，如：色譜柱的型號(hào)、進(jìn)樣口溫度、柱溫、載氣流速、進(jìn)樣模式等。(2)確定質(zhì)譜條件，如氣質(zhì)接口溫度、離子源溫度、四級(jí)桿溫度、EI電離能量、檢測(cè)模式等。(3)進(jìn)行方法學(xué)考察，測(cè)定

5、樣品含量。 結(jié)果：1.GC法：(1)色譜條件如下：固定相為100％二甲基硅氧烷的HP-1毛細(xì)管柱(50m×320μm×0.52μm)，柱溫：265℃；進(jìn)樣口溫度：295℃；ECD檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度：300℃；載氣為高純氮?dú)?，流速?.0mL·min-1；進(jìn)樣量1μL，分流進(jìn)樣，分流比20:1。(2)該法重復(fù)性良好，RSD為0.1％，平均回收率為99.5％，RSD為0.4％(n=9)。3批樣品的含量均大于97％。2.GC-MS法：

6、(1)色譜條件：色譜柱DB-1ms毛細(xì)管柱(30m×250μm×0.25μm)；載氣為高純氦氣，流速0.8mL·min-1；升溫程序：在200℃的基礎(chǔ)上20℃·min-1升溫至260℃，恒溫5min，然后10℃·min-1。升至300℃，恒溫3min結(jié)束，運(yùn)行時(shí)間15min；進(jìn)樣口溫度250℃；不分流進(jìn)樣。(2)質(zhì)譜條件：氣質(zhì)接口溫度250℃；離子源溫度230℃；四級(jí)桿溫度150℃：EI電離方式，電子能量70ev；檢測(cè)模式為SIM模式；

7、用于定量的特征質(zhì)譜峰為m/z 266.0，210.0(間尼索地平)和m/z 296.0，254.0(內(nèi)標(biāo)尼莫地平)，溶劑延遲4min。(3)該法重復(fù)性的RSD為0.4％，平均回收率為98.9％，RSD為0.3％(n=9)。結(jié)論：本文建立了GC和GC-MS法測(cè)定間尼索地平原料藥含量的方法，該法準(zhǔn)確、靈敏、快速，可用于間尼索地平的含量測(cè)定。 第二部分間尼索地平體外代謝研究目的：研究間尼索地平在大鼠肝微粒體內(nèi)的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；通過肝微

8、粒體溫孵、微生物轉(zhuǎn)化、腸道菌厭氧培養(yǎng)等多種方法尋找代謝物，并盡可能的制備轉(zhuǎn)化產(chǎn)物單體。 方法：1.酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究：(1)確定色譜條件及樣品處理方法。(2)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。(3)考察時(shí)間、蛋白濃度、底物濃度等因素對(duì)間尼索地平在大鼠肝微粒體中代謝消除速率的影響。2.肝微粒溫孵實(shí)驗(yàn)：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法將間尼索地平加入微粒體溫孵液中，溫孵一定時(shí)間后，處理并采用HPLC-PDA和HPLC-MS分析，確認(rèn)代謝物。3.微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：經(jīng)過

9、篩選，選出轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)的菌株對(duì)間尼索地平進(jìn)行轉(zhuǎn)化，制備轉(zhuǎn)化產(chǎn)物單體，通過MS、NMR等波譜數(shù)據(jù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)。4.腸道菌培養(yǎng)：取大鼠糞便，利用腸道菌培養(yǎng)的方法，研究間尼索地平的代謝。5.胃內(nèi)容物溫孵：取新鮮大鼠胃內(nèi)容物加入間尼索地平進(jìn)行溫孵，采用HPLC-PDA分析。 結(jié)果：1.酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究：(1)色譜條件：色譜柱：Welchrom C18柱(4.6mmx250mm×5μm)，流動(dòng)相：乙腈-水(62:38)，流速：1.0m

10、L.min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：237nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20μL。樣品處理方法：取溫孵體系1.0mL，加入5mol·L-1氫氧化鈉溶液200μL，渦旋20s，再加入乙醚-正己烷(1∶1)混合液5mL，渦旋2min，于2850×g離心5min，取上層有機(jī)相3mL，37℃N2吹干，殘留物用甲醇40μL溶解后經(jīng)HPLC測(cè)定。(2)方法精密度好，日內(nèi)、日間精密度RSD分別為6.1％和1.6％(n=15)，準(zhǔn)確度高，回收率為93.0％，RSD

11、為3.8％(n=15)。(3)間尼索地平的消除速率受時(shí)間、蛋白濃度、底物濃度等因素的影響，因這些因素的不同而不同。2.肝微粒體溫孵實(shí)驗(yàn)：在大、小鼠肝微粒體中發(fā)現(xiàn)了間尼索地平的多個(gè)代謝物，但二者有所不同，說明間尼索地平的代謝存在種屬差異。3.微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：經(jīng)篩選，發(fā)現(xiàn)雅致小克銀漢霉(Cunninghamella elegans，AS3.1207)對(duì)間尼索地平的代謝能力強(qiáng)，重現(xiàn)性好，由此得到一轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，確認(rèn)其結(jié)構(gòu)為1，4-二氫-2，6-二

12、甲基-4-(3-硝基苯基)-3，5-吡啶二羧酸甲酯-(2-甲基-2-羥基)丙基酯(文中均以字母M表示)。4.從腸道菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)4個(gè)溫孵產(chǎn)物，但空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)也有類似產(chǎn)物，對(duì)這些產(chǎn)物是否為腸道菌的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物應(yīng)做進(jìn)一步的研究。5.胃內(nèi)容物溫孵液中沒有發(fā)現(xiàn)代謝物。結(jié)論：通過微生物轉(zhuǎn)化法得到一轉(zhuǎn)化產(chǎn)物單體，確認(rèn)了其結(jié)構(gòu)，從肝微粒體溫孵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)間尼索地平的代謝存在種屬差異。 第三部分間尼索地平體內(nèi)代謝研究目的：尋找間尼索地平在大鼠體內(nèi)代謝物

13、的同時(shí)研究間尼索地平及其代謝物在大鼠體內(nèi)的過程，盡可能解釋間尼索地平的代謝途徑。 方法：收集灌胃給予間尼索地平后大鼠的胃、小腸、肝組織、血液、尿液、膽汁、糞便等生物樣品，采用HPLC-PDA分析，以紫外吸收光譜為依據(jù)，尋找代謝物，對(duì)膽汁、糞便等樣品進(jìn)行HPLC-MS分析。結(jié)果：體內(nèi)生物樣品中除肝組織、血液、尿液中沒有發(fā)現(xiàn)代謝物外，胃、小腸、膽汁、糞便均有所發(fā)現(xiàn)。 結(jié)論：間尼索地平在大鼠體內(nèi)發(fā)生廣泛的生物轉(zhuǎn)化，在膽汁中能檢