紫杉醇-Pluronic P123復合型膠束給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、紫杉醇(paclitaxel，PTX)是首選的抗腫瘤藥物之一[1]。紫杉醇是從紅豆杉屬植物的樹皮中分離提取的一種四環(huán)二萜類化合物，作用機制為與細胞的微管結(jié)合，促進微管聚合，抑制微管解聚，從而在細胞內(nèi)形成穩(wěn)定的微管束，進而抑制細胞分裂和增殖，使腫瘤細胞停止在G2期和M期，達到抑制腫瘤細胞生長的目的[2]。紫杉醇抗腫瘤譜廣、治療指數(shù)高，近年來被廣泛用于卵巢癌[3]、乳腺癌[4]、頭頸部腫瘤[5]、前列腺癌以及非小細胞肺癌[6]等的治療。PT

2、X在水中的溶解度極小，口服生物利用度差。目前上市的紫杉醇制劑有兩種:紫杉醇注射液（泰素(R)）和紫杉醇白蛋白納米粒(Abraxane(R))注射劑。前者含有機溶劑，會引起中性粒細胞減少，骨髓抑制及室性心律不齊等副作用，且無藥物靶向性;后者采用人血白蛋白制備，其來源受到一定限制，且價格非常昂貴。這些都限制了紫杉醇的臨床應用。
　　 聚合物膠束是靶向領(lǐng)域中的一種新型藥物載體，近年來受到了廣泛的關(guān)注，并成為紫杉醇藥物遞送領(lǐng)域最重要的發(fā)

3、展方向之一。兩親性共聚物在水介質(zhì)中可自發(fā)形成具有“核殼”結(jié)構(gòu)的聚合物膠束，疏水嵌段形成膠束的內(nèi)核，充當疏水藥物的儲存區(qū)，顯著提高藥物的溶解性和穩(wěn)定性[7];親水嵌段在水性環(huán)境中伸展并圍繞在疏水內(nèi)核的周圍形成親水性外殼，能有效減少血漿蛋白對膠束的吸附，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞的識別和吞噬，使膠束在血液中保持穩(wěn)定，延長循環(huán)時間，并利用EPR效應介導被動靶向。藥物分子可通過物理包封和化學結(jié)合等手段包裹于聚合物膠束的內(nèi)核。
　　 本課題旨在研發(fā)

4、新的給藥系統(tǒng)提高紫杉醇的水溶性，避免有機溶劑的使用，同時選擇合適的腫瘤靶向因子將紫杉醇選擇性的運送到腫瘤細胞或組織，減少藥物在正常組織或器官的分布，降低其不良反應。Pluronic系列共聚物是一種多功能藥用輔料嵌段，具有無毒、無免疫原性、生物相容性等優(yōu)點，還能抑制P-糖蛋白對藥物外排作用，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥性，提高藥物的活性。其中，PluronicP123(PEO20-b-PPO69-b-PEO20)的疏水嵌段較長，組裝形成的疏水內(nèi)

5、核容量較大，期待其能提高藥物載藥量。將紫杉醇通過化學結(jié)合連接到PluronicP123上得到P123-PTX結(jié)合物，在此基礎(chǔ)上，通過物理包封的方法將游離藥物包裹于P123-PTX聚合物膠束的疏水內(nèi)核。載藥聚合物膠束進入腫瘤組織中能夠首先迅速釋放物理包封的藥物，達到有效的治療濃度，之后化學鍵連接的藥物再緩慢釋放，維持有效的治療濃度，達到更好的治療效果。之后采用葉酸作為靶向因子，對親水外殼進行靶向修飾，獲得主動靶向的聚合物膠束?？疾炝似潴w外

6、理化性質(zhì)，評價了其體內(nèi)外抗腫瘤效果，為紫杉醇靶向膠束制劑的開發(fā)提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本課題主要分三部分研究了紫杉醇的PluronicP123膠束制劑，研究內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　 一、紫杉醇PluronicP123膠束制劑含量測定方法的建立
　　 采用紫外分光光光度法測定紫杉醇PluronicP123膠束制劑中化學連接的紫杉醇含量，高效液相色譜法測定膠束制劑中物理包封的紫杉醇的含量，并對方法學進行了研究。方法學考察結(jié)果

7、符合要求，回收率高，重現(xiàn)性好。
　　 二、被動靶向載紫杉醇的PluronicP123膠束制劑的研究
　　 用丁二酸酐將紫杉醇的2'位羥基轉(zhuǎn)化為羧基，進而與PluronicP123上的羥基形成酯鍵得到P123-PTX結(jié)合物。用質(zhì)子核磁共振光譜(1H-NMR)驗證了P123-PTX結(jié)合物的結(jié)構(gòu)。由于其仍具有兩親性，P123-PTX結(jié)合物在水介質(zhì)中可自組裝形成P123-PTX膠束，或作為聚合物載體材料，進一步物理包封紫杉醇制備

8、P123-PTX/PTX膠束。P123-PTX膠束與P123-PTX/PTX膠束均通過透析法制備而成;單因素考察了P123-PTX/PTX膠束的制備工藝和處方;研究了P123-PTX膠束和P123-PTX/PTX膠束載藥量、包封率、外觀形態(tài)、粒徑分布和Zeta電位等理化性質(zhì);分別在pH值為5.0和7.4的PBS中研究了P123-PTX膠束和P123-PTX/PTX膠束的體外釋藥行為。
　　 與紫杉醇原料比較，羧基化紫杉醇的1H-

9、NMR譜中清楚地觀察到額外出現(xiàn)δ2.5-2.7處的多重峰，其代表丁二酸酐OCOCH2CH2COOH上質(zhì)子的化學位移峰，證明羧基化紫杉醇的成功合成。與PluronicP123原料比較，P123-PTX結(jié)合物1H-NMR譜中出現(xiàn)一系列新的吸收峰，正好與紫杉醇的1H-NMR譜相對應，可知紫杉醇成功連接到PluronicP123上;紫外可見分光光度法測得P123-PTX膠束中化學連接的紫杉醇含量為(14.00±0.36)％，高效液相色譜法測得P

10、123-PTX/PTX膠束中物理包封的紫杉醇含量為（4.67±0.13）％，因此P123-PTX/PTX膠束的總載藥量為(18.69±0.52)％;TEM觀察P123-PTX/PTX膠束呈現(xiàn)球形或類球形，形態(tài)規(guī)整，大小均勻;DLS測得P123-PTX膠束和P123-PTX/PTX膠束的平均粒徑分別為(60.12±5.26)nm和(102.63±7.36)nm;Zeta電位分別是(-6.66±0.88)mV和(-11.13±0.62)mV

11、。體外釋放結(jié)果表明，物理包封PTX制備的P123-PTX/PTX膠束的藥物釋放明顯比P123-PTX快;此外，可能由于酯鍵的pH敏感性，P123-PTX膠束與P123-PTX/PTX膠束的在不同pH的釋放介質(zhì)中的體外釋藥行為都表現(xiàn)出pH敏感。在pH7.4的釋放介質(zhì)中，藥物釋放緩慢，而在pH5.0條件下，藥物釋放加速。
　　 三、主動靶向載紫杉醇的PluronicP123膠束制劑的研究
　　 利用葉酸上的羧基與P123-P

12、TX上剩余的羥基通過反應制得FA-P123-PTX結(jié)合物，用質(zhì)子核磁共振光譜(1H-NMR)驗證了FA-P123-PTX結(jié)合物的結(jié)構(gòu)，并用紫外分光光度法測定了葉酸的修飾率。P123-PTX與FA-P123-PTX通過與FITC反應得到了帶熒光標記的P123-PTX-FITC與FA-P123-PTX-FITC結(jié)合物。通過透析法將FA-P123-PTX結(jié)合物作為載體材料物理包封PTX制備了主動靶向FA-P123-PTX/PTX膠束制劑。單因

13、素考察了FA-P123-PTX/PTX膠束的制備工藝和處方;同時通過透析法制備FA-P123-PTX膠束作為對照，熒光標記的P123-PTX-FITC與FA-P123-PTX-FITC結(jié)合物膠束用于細胞攝取實驗。研究了FA-P123-PTX/PTX膠束載藥量、包封率、外觀形態(tài)、粒徑分布和Zeta電位等理化性質(zhì);分別在pH值為5.0和7.4的PBS中研究了FA-P123-PTX膠束和FA-P123-PTX/PTX膠束的體外釋藥行為;考察了

14、人肺癌細胞系A(chǔ)549、人乳腺癌細胞系MCF-7和小鼠黑色素癌細胞系B16細胞對熒光標記的P123-PTX-FITC與FA-P123-PTX-FITC結(jié)合物膠束的攝取;采用MTT法和AnnexinV-FITC/PI雙染法研究了紫杉醇膠束制劑對A549、MCF-7和B16細胞的體外抗腫瘤活性;采用接種鼠源B16黑色素瘤的昆明小鼠，考察了紫杉醇膠束制劑的體內(nèi)抗腫瘤活性;采用健康昆明小鼠，考察了紫杉醇膠束制劑的最大耐受劑量。
　　 由于

15、FA-P123-PTX是在P123-PTX基礎(chǔ)上進行修飾，所以FA-P123-PTX/PTX膠束中化學連接的紫杉醇含量與P123-PTX膠束中紫杉醇含量一致，仍為(14.00±0.36)％。而通過HPLC法測得的FA-P123-PTX/PTX膠束中物理包封的紫杉醇為(4.07±0.12)％，因此FA-P123-PTX/PTX膠束的總載藥量為(18.08±0.64)％;DLS測得其平均粒徑為(147.57±2.82)nm;Zeta電位為(

16、-9.31±1.07)mV。體外釋放實驗表明，F(xiàn)A-P123-PTX膠束與FA-P123-PTX/PTX膠束仍表現(xiàn)出pH敏感性。細胞攝取試驗表明，細胞對熒光標記的兩種膠束制劑的攝取率均隨時間的延長而增強。在葉酸受體陽性細胞MCF-7和B16細胞中，F(xiàn)A-P123-PTX-FITC膠束在細胞中的蓄積程度要顯著高于非靶向組P123-PTX-FITC膠束，而在葉酸受體陰性細胞A549中，兩者的攝取率無顯著性差異，這說明葉酸介導的膠束載體具有顯

17、著的靶向性。體外細胞實驗結(jié)果顯示，與泰素(R)相比，P123-PTX膠束對A549、MCF-7和B16細胞的IC50值均高于泰素(R)組的IC50值，這可能由于酯鍵斷裂需要時間，釋放藥物的速度較慢，難以在短時間內(nèi)達到有效的藥物濃度。但P123-PTX/PTX膠束的IC50值明顯低于P123-PTX膠束，這表明通過化學結(jié)合與物理包封聯(lián)合制備的膠束制劑的藥效要優(yōu)于單獨使用化學結(jié)合的膠束制劑，可明顯抑制腫瘤細胞生長。在葉酸受體陽性細胞MCF-

18、7和B16細胞中，主動靶向FA-P123-PTX/PTX膠束的IC50值明顯低于泰素(R)和被動靶向P123-PTX/PTX膠束組，而在葉酸受體陰性細胞A549中，主動靶向膠束與被動靶向膠束的IC50值無明顯差異。細胞凋亡實驗結(jié)果與MTT法結(jié)果一致。因此，體外細胞實驗中，與被動靶向膠束相比，主動靶向膠束對葉酸受體陽性細胞顯示出較強的抗腫瘤活性。
　　 體內(nèi)藥效學實驗結(jié)果表明，P123-PTX膠束與泰素(R)的抑瘤效果無差異(P＞

19、0.05)，P123-PTX/PTX膠束組較泰素(R)和P123-PTX膠束組又有更好的治療效果(P＜0.05)。FA-P123-PTX/PTX組與P123-PTX/PTX組比較，小鼠瘤體積又有所減小(P＜0.05)，表明通過化學結(jié)合和物理包封制備的P123-PTX/PTX膠束要比僅化學結(jié)合的P123-PTX膠束和泰素(R)療效好，主動靶向制劑要比被動靶向制劑療效好。同時小鼠體重變化也有差異，其中泰素(R)組小鼠體重增加最少(P＜0.0

20、1)。由于體重變化是判斷制劑毒性的一個重要指標，且小鼠對P123-PTX/PTX膠束與FA-P123-PTX/PTX膠束的最大耐受劑量為150mg/kg和200mg/kg，遠遠高于泰素(R)的50mg/kg。因此上述結(jié)果說明各紫杉醇PluronicP123膠束制劑的毒性作用均小于市售注射液泰素(R)，具有臨床用藥的價值。
　　 綜上所述，本研究制備的紫杉醇PluronicP123膠束制劑是一種紫杉醇新劑型，能夠顯著提高紫杉醇的溶