雞APN組織定量、表達(dá)及其作為IBV受體可能性評價.pdf

1、APN作為多種Ⅰ群冠狀病毒的功能性受體，在冠狀病毒感染細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用。受體利用在冠狀病毒幾個群及屬之間一致性很少，冠狀病毒似乎可以采用多種策略便于與宿主受體結(jié)合從而與靶細(xì)胞發(fā)生相互作用。作為冠狀病毒的IBV進入細(xì)胞也必然利用受體， IBV的功能性受體是僅存在于雞體內(nèi)的一種特異性蛋白，鑒于多種Ⅰ群冠狀病毒使用APN作為自身受體，雞APN（氨肽酶N）作為可能受體與雞傳染性支氣管炎病毒（Avian infectious bronchit

2、is virus，IBV）感染密切相關(guān)，使IBV感染普遍存在于全身各臟器。
　　 鑒于APN可能作為IBV受體這一假設(shè)，本研究針對以下幾個問題開展工作：APN的酶活性與IBV的組織嗜性之間是否存在相關(guān)性？APN的自然分布與IBV的組織嗜性之間是否存在一定的規(guī)律？APN的動態(tài)分布與酶活性高低與IBV的感染先后順序及持續(xù)感染是否存在一定的聯(lián)系？APN能否幫助IBV感染異源細(xì)胞？
　　 本實驗主要具體的研究內(nèi)容、方法和結(jié)果如下

3、：
　　 1.為研究IBV組織嗜性與APN的分布之間的關(guān)系需要了解APN的酶活性分布及各組織m RNA表達(dá)量的差異。本實驗對APN酶活性及m RNA表達(dá)量分別進行了定量研究。采用分光光度法測定不同日齡雛雞各主要組織器官等量總蛋白與APN特異底物leu-pna相同反應(yīng)條件反應(yīng)后于410nm處吸光度的改變，以這一改變表示各組織部位蛋白中APN酶活性差異，結(jié)果表明IBV的組織嗜性與APN酶活性存在一定的相關(guān)性，但規(guī)律性不強；采用熒光定

4、量PCR的方法測定不同日齡雛雞主要組織器官中APN的m RNA表達(dá)量，結(jié)果表明IBV的組織嗜性與APN的自然分布存在明顯的正相關(guān)性，幼齡家禽APN表達(dá)量高于成熟家禽；IBV易于侵蝕的腎臟、呼吸道、肺臟等含量相對穩(wěn)定，腸道APN含量后期增高，顯示腸道APN的后期表達(dá)與IBV的持續(xù)感染存在相關(guān)性，符合了APN可能作為IBV感染相關(guān)受體的假設(shè)；
　　 2.為進一步研究雞APN的性質(zhì)，本實驗成功從雞胚腎臟中克隆到全長雞APN基因，與公布

5、序列同源性高達(dá)99.48％，構(gòu)建了原核表達(dá)重組載體，使雞APN在體外得到了高效表達(dá)，原核表達(dá)得到的蛋白為包涵體形式，可用于進一步研究APN在IBV感染中的作用；
　　 3.為探索雞APN在啟動IBV感染細(xì)胞是否存在作用，本研究成功構(gòu)建了攜帶綠色熒光蛋白的APN真核表達(dá)重組載體并對BHK-21細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，使得APN在BHK-21細(xì)胞上得到高效表達(dá)，轉(zhuǎn)染APN后IBV對BHK-21變得易感，病毒大量繁殖，而且隨著代次的增加感染出現(xiàn)