創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因犬的相關(guān)基礎(chǔ)研究.pdf

1、2005年底完成的犬全基因組圖譜，揭示了其基因與人類的相似程度高于人與小鼠等多數(shù)動(dòng)物，同時(shí)發(fā)現(xiàn)犬有360多種遺傳疾病與人類相似。因此，在生物醫(yī)藥研究中，犬(Canis familiaris)是最重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，轉(zhuǎn)基因犬或基因敲除犬是研究人類基因功能、遺傳性疾病的理想模型動(dòng)物。雖然人類已成功獲得轉(zhuǎn)基因小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、牛、羊、豬、兔等十多種哺乳動(dòng)物動(dòng)物或家畜，越來越多的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已運(yùn)用到生物醫(yī)藥領(lǐng)域，但由于犬生殖器官結(jié)構(gòu)和生殖生

2、理的特殊性，其基礎(chǔ)生物學(xué)、生殖的人工調(diào)控研究進(jìn)展非常緩慢。但到目前為止，人類尚未獲得轉(zhuǎn)基因犬。本文以Beagle(畢格)犬為研究載體，分別以雌性動(dòng)物和雄性動(dòng)物為對(duì)象，開展創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因犬的相關(guān)基礎(chǔ)研究。研究分為以下三個(gè)部分。 1 Beagle母犬的生殖生物學(xué)研究傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究是以雌性動(dòng)物為對(duì)象，擬創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因犬的首選技術(shù)路線也是如此。為了給該途徑的實(shí)驗(yàn)提供可供參考的基礎(chǔ)資料，本部分對(duì)Beagle母犬的基礎(chǔ)生殖生物學(xué)進(jìn)行研究。對(duì)揚(yáng)

3、州和蘇州兩個(gè)Beagle犬養(yǎng)殖基地、共463只胎次、2-5胎母犬連續(xù)3年的觀察和資料分析，發(fā)現(xiàn)母犬一年四季均有發(fā)情和產(chǎn)仔，但呈一定的季節(jié)分布，春秋兩季為發(fā)情旺季，兩地分別占全年發(fā)情總數(shù)的71.0％和72.8％，發(fā)情的平均間隔時(shí)間為34周，平均妊娠期為62.9天，平均胎產(chǎn)仔數(shù)5.35只。揚(yáng)州和蘇州兩地母犬的上述繁殖性能未見明顯差異。 母犬生殖器官大體解剖顯示，卵巢被卵巢囊包裹，彎曲而短小的輸卵管行走于卵巢囊壁內(nèi)。卵泡隨著發(fā)育而凸至

4、卵巢表面，發(fā)情期卵巢為瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)。組織學(xué)研究顯示：初生時(shí)，卵巢的皮質(zhì)部含有大量的原始卵泡，3月齡出現(xiàn)初級(jí)卵泡，6月齡出現(xiàn)次級(jí)卵泡，9月齡出現(xiàn)成熟卵泡。不同月齡的卵巢均可見多卵卵泡，其數(shù)量隨年齡增長呈下降趨勢。在初生時(shí)，子宮腺體的體積小、數(shù)量少，以后不斷發(fā)育增生，腺體周圍的基質(zhì)也逐漸密集。初生至9月齡的母犬輸卵管粘膜僅形成初級(jí)皺襞，12月齡后開始出現(xiàn)較多次級(jí)皺襞，幾乎充滿整個(gè)管腔。卵巢的類固醇激素一雌二醇(E2)和孕酮(P)是雌性動(dòng)物最重要

5、的生殖激素，其不僅調(diào)控著動(dòng)物性器官發(fā)育、成熟、性行為產(chǎn)生、妊娠、分娩等生理活動(dòng)，也是檢測、觀察動(dòng)物生殖行為的重要指標(biāo)。放射免疫分析法測定初生至性成熟前及其發(fā)情前期至分娩，Beagle母犬的卵巢類固醇激素分泌的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示：血清中E2的濃度在初生時(shí)很低，3月齡開始逐漸升高，9月齡后一直維持于20 pg／ml左右；初生時(shí)檢不出血清中P，以后雖然有所升高，但一直維持于較低水平(<0.6ng/ml)。性成熟后的經(jīng)產(chǎn)母犬，在乏情期，E2和P

6、均維持在較低的水平。進(jìn)入發(fā)情前期后，E2濃度逐漸升高，至接受交配前的第4天出現(xiàn)第一個(gè)分泌高峰，濃度達(dá)75pg／ml，并維持?jǐn)?shù)天，以后有所下降；直至交配受孕后的第18天，由于黃體的分泌作用，出現(xiàn)第二個(gè)高峰;在妊娠的最后階段降至發(fā)情前期開始之前的水平。發(fā)情前期開始后，P濃度緩慢升高；發(fā)情前期的晚期迅速升高，從排卵配種前的第4天至排卵配種日，P從2.7ng／ml升高到10.9ng／ml；以后P不斷升高，至妊娠14天達(dá)到39.4.ng／ml的峰

7、值，并以較高濃度維持一段時(shí)間；在妊娠后期至分娩，其逐漸下降，分娩時(shí)孕酮的濃度已降至1ng／ml以下。 雌性動(dòng)物性器官的發(fā)育與生殖活動(dòng)，除與外周血中的性激素水平有關(guān)，還與生殖器官、腺垂體中雌激素受體(ER)和孕酮受體(PR)的數(shù)量有關(guān)。非同位素原位雜交(ISH)法檢測犬生殖器官、垂體中雌激素受體α(ERα)mRNA和孕酮受體(PR)mRNA的相對(duì)表達(dá)豐度，結(jié)果顯示：ERamRNA陽性斑點(diǎn)主要出現(xiàn)在各級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞、子宮

8、腺體細(xì)胞和垂體的腺體細(xì)胞，卵巢中大卵泡的陽性率明顯高于小卵泡，即卵泡的發(fā)育程度與ERmRNA表達(dá)豐度存在密切關(guān)系。卵巢在3月齡開始表達(dá)ERamRNA，以后逐漸增加，至9月齡后維持在較高的水平；發(fā)情前期和發(fā)情期卵巢的ERamRNA表達(dá)水平高于其它時(shí)期。子宮ERamRNA的陽性率，從初生至15月齡，隨內(nèi)膜腺體細(xì)胞的數(shù)量和體積同步增加，陽性率隨日齡增長而增加；由發(fā)情前期過渡到發(fā)情期后，ERamRNA表達(dá)呈下降趨勢。垂體腺體細(xì)胞的ERamRNA

9、在3月齡后一直維持在較高的水平：在發(fā)情周期，發(fā)情前期的晚期開始，ERamRNA表達(dá)呈下降趨勢。PRmRNA主要原位雜交陽性信號(hào)集中于各級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞、有腔卵泡與排卵前卵泡的內(nèi)膜細(xì)胞和黃體細(xì)胞中、子宮腺體細(xì)胞和腦垂體的腺體細(xì)胞。初生未見卵巢PRmRNA的表達(dá)，3～18月齡之間的陽性率呈增長趨勢；PRmRNA表達(dá)水平在發(fā)情前期較高，第9天達(dá)到較高水平。12月齡前的母犬子宮，幾乎不表達(dá)PRmRNA：在發(fā)情前期開始后，PRmRNA表達(dá)呈上升趨

10、勢。初生時(shí)，母犬腦垂體PRmRNA幾乎不表達(dá)，隨著月齡的增加，PRmRNA在3月齡和6月齡表達(dá)水平較高，后表達(dá)水平下降。在發(fā)情周期PRmRNA一直維持在較低的水平。以上犬基礎(chǔ)生殖生物學(xué)研究結(jié)果，不僅豐富了犬生殖生物學(xué)資料，更重要的是為犬誘導(dǎo)發(fā)情、同步發(fā)情、超數(shù)排卵研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)安排提供了理論依據(jù)。 2以雌性動(dòng)物為對(duì)象創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因犬相關(guān)輔助生殖技術(shù)研究以雌性動(dòng)物為對(duì)象創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因犬研究，首先要有大量的原核期受精卵用于胚胎操作。但犬為單

11、發(fā)情動(dòng)物，有較長的乏情期，人工誘導(dǎo)發(fā)情困難：在解剖上，犬的卵巢被厚厚的卵巢囊包裹，很難用腹腔鏡技術(shù)從卵巢取卵。利用淘汰犬卵巢取卵，體外培養(yǎng)成熟、體外受精是一項(xiàng)重要的輔助生殖技術(shù)(ART)。我們以切割法采集卵巢上未成熟卵母細(xì)胞，建立了犬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的方法，獲得了成熟的卵母細(xì)胞。結(jié)果顯示：發(fā)情前期和發(fā)情期母犬卵巢的一級(jí)卵母細(xì)胞回收率較高，3歲犬平均回收的數(shù)量最多，而1歲以下幼犬和7歲以上老犬的回收率最低。在以M199作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液中

12、，聯(lián)合添加內(nèi)皮生長因子(EGF)和雌二醇(E2)，可促進(jìn)犬卵母細(xì)胞成熟，以發(fā)育至MⅡ期的卵母細(xì)胞比例為指標(biāo)，其成熟率高于單獨(dú)添加組和對(duì)照組(22.58％ vs 18.00％、 5.56％，4.76％)。添加20％的FBS，其卵成熟率與添加20％的EDS無顯著差異(17.14％ vs 17.95％)，但均顯著高于對(duì)照組(0％)。EGF雖可促進(jìn)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展，但對(duì)卵母細(xì)胞的成熟無劑量依賴性。卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的時(shí)間以72h為優(yōu)。

13、人工誘導(dǎo)發(fā)情是又一項(xiàng)重要的輔助生殖技術(shù)。本研究以肌肉注射促性腺激素的方法對(duì)乏情期犬、青年不發(fā)情犬和老齡不育犬進(jìn)行人工誘導(dǎo)發(fā)情實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：外源激素1200IU PMSG+500IU HCG能有效地誘導(dǎo)乏情期犬和青年不發(fā)情犬的發(fā)情，而對(duì)老齡不育犬的誘導(dǎo)效果不明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在PMSG總劑量(1200IU)不變的情況下，一次給藥的總誘導(dǎo)發(fā)情、成功配種率為40％(6／15)，其中乏情期犬的成功配種率為50％(4／8)；少量多次給藥誘導(dǎo)發(fā)情的總

14、成功率為50％(15／30)，其中乏情期犬的成功配種率為69％(11／16)，并有31％(5／16)的母犬妊娠產(chǎn)仔，產(chǎn)仔母犬表現(xiàn)出與自然繁殖母犬同樣的激素變化規(guī)律。提示PMSG+HCG組合、少量多次給藥的方法可有效誘導(dǎo)乏情期經(jīng)產(chǎn)母犬的發(fā)情，縮短發(fā)情間隔時(shí)間，為轉(zhuǎn)基因犬制作提供更多的發(fā)情母犬。胚胎移植是以雌性動(dòng)物路線創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因犬的關(guān)鍵輔助生殖技術(shù)。我們以自然發(fā)情同步母犬配對(duì)供體和受體的策略，采取外科手術(shù)的方法開展犬受精卵輸卵管移植的研究，

15、并首次獲得成活仔犬。在移入49枚1-8細(xì)胞受精卵的12只受體中，有3只母犬于卵母細(xì)胞受精(供體初次配種)后的第61天～65天成功分娩，產(chǎn)仔6只，分娩率為25％(3／12)． 3 以雄性動(dòng)物為對(duì)象創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因犬的部分基礎(chǔ)研究在以雌性動(dòng)物為對(duì)象創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因犬的努力屢屢遭受挫折后，本課題又對(duì)以雄性動(dòng)物為對(duì)象創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因犬的技術(shù)進(jìn)行了初步探索。該轉(zhuǎn)基因策略可分為精原干細(xì)胞的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移與體外基因轉(zhuǎn)移，后者又包括精原干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、受體內(nèi)源性

16、精原干細(xì)胞的消除、轉(zhuǎn)基因精原干細(xì)胞的移植重建、人工采精及其陽性精子篩選、體外顯微受精等主要環(huán)節(jié)。本文對(duì)體外途徑的若干程序作了探索性研究。在精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)中，以外科手術(shù)摘取4-5月齡Beagle公犬睪丸，體外酶消化睪丸組織制作細(xì)胞懸液，以貼壁差異法純化分離精原干細(xì)胞(SSCs)，DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基體外培養(yǎng)純化的精原干細(xì)胞，并在體外對(duì)培養(yǎng)的SSCs進(jìn)行EGFP基因轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示：4-5月齡的Beagle公犬可獲得較多的SSCs：

17、0.2mg/ml膠原酶Ⅳ+0.25％胰蛋白酶兩步酶消化法的分離效果最好，每100mg睪丸組織分離的SCCs總數(shù)和成活細(xì)胞比例分別為6.67x106和95.5％；經(jīng)AKP染色法鑒定，以貼壁差異法純化SSCs，其純度達(dá)50.7％；在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加10％胎牛血清(FBS)和20ng/ml EGF顯著提高了SCCs集落數(shù)。SCCs體外轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)顯示，EGFP基因可以在SCCs上表達(dá)，其中陽離子聚合物轉(zhuǎn)染法的表達(dá)效率明顯優(yōu)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染法