中國人隱球菌腦膜炎流行特征和CD44-脂筏-Src信號通路在新生隱球菌侵入人肺泡上皮細(xì)胞中的作用機(jī)制.pdf

1、背景:
　　新生隱球菌(Cryptococcus neoformans，CN)是具有莢膜的人類重要病原真菌，主要引起隱球菌腦膜炎(Cryptococcus meningitis，CM)，癥狀兇險，病死率高，免疫功能低下患者是易感人群。新生隱球菌存在于鴿糞、土壤等自然環(huán)境中，主要的入侵途徑是呼吸道。新生隱球菌也可見于人體正常微生物群中，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時發(fā)生感染，如易發(fā)于艾滋病、糖尿病和白血病等患者。近年來，由于AIDS病的增多、移

2、植術(shù)后免疫抑制劑和抗腫瘤化療藥物的使用，導(dǎo)致新生隱球菌感染發(fā)病率大大升高，在歐美已成為艾滋病患者常見的并發(fā)癥之一。全球每年新發(fā)病例100萬，死亡70萬，而抗真菌藥物有限，藥物的副作用和耐藥性也給有效治療造成很大困難。
　　隱球菌腦膜炎是最為嚴(yán)重的隱球菌病。在歐美，80％隱球菌病發(fā)生在HIV/AIDS人群。但是，在中國，近年來非HIV/AIDS患者和免疫正常人患隱球菌腦膜炎的報道逐漸增多，隱球菌腦膜炎在我國主要發(fā)生在HIV/AIDS

3、患者還是非HIV/AIDS患者，是否存在導(dǎo)致免疫功能降低的基礎(chǔ)疾病及疾病譜，目前尚不清楚，需要進(jìn)行中國人隱球菌腦膜炎流行病學(xué)特征的分析。
　　早在1894年，人們就已從人體和桃汁中分離出新生隱球菌，其廣泛分布于土壤、鴿子糞便、桉樹等自然環(huán)境中，鴿糞、桉樹等中的隱球菌孢子播散在空氣中，可經(jīng)呼吸道吸入，在多數(shù)患者體內(nèi)引起一過性肺炎，被肺泡吞噬細(xì)胞吞噬消滅，如果未被消滅，該菌穿過肺-血屏障進(jìn)入血液則引起隱球菌菌血癥，由于其嗜神經(jīng)性，穿越

4、血腦屏障導(dǎo)致嚴(yán)重的隱球菌腦膜炎或腦炎。新生隱球菌穿過人體第一道屏障即肺泡-毛細(xì)血管屏障（肺-血屏障），是其侵入血流向全身特別是腦部血行播散的關(guān)鍵步驟，但該菌如何穿過由人肺泡上皮細(xì)胞、基底膜和人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的肺-血屏障的機(jī)制尚未弄清，國內(nèi)外相關(guān)研究也較少。如果弄清新生隱球菌侵入人肺泡上皮細(xì)胞的關(guān)鍵受體及相關(guān)信號通路，將進(jìn)一步揭示新生隱球菌感染的致病機(jī)制，并為此病的治療提供重要的藥物阻斷靶位。
　　新生隱球菌的主要毒力因子為莢

5、膜多糖(如GXM和GalXM)以及可溶性胞外組分，與其抗吞噬功能有關(guān)。Ambrose.Jong研究發(fā)現(xiàn)莢膜透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，HA)是新生隱球菌侵襲人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要毒力因子。
　　CD44屬于介導(dǎo)細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞間黏附的黏附因子，廣泛表達(dá)于多種內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞等，分子量約80-95KD，是透明質(zhì)酸HA的受體。CD44受體與HA結(jié)合后激活下游信號分子Src激酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排的信

6、號通路:在腫瘤細(xì)胞中，CD44的胞外域與宿主細(xì)胞或間質(zhì)中HA結(jié)合，胞內(nèi)域在單個位點與Src激酶高親和力結(jié)合，HA與CD44的相互作用刺激Src激酶的活性，使細(xì)胞骨架蛋白cortactin的酪氨酸磷酸化，降低cortactin與絲狀肌動蛋白交聯(lián)的能力，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排，腫瘤細(xì)胞移動和侵襲。研究表明:Src激酶信號參與大腸桿菌侵入人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的過程;Src激酶還涉及葡萄球菌侵入胚腎細(xì)胞、志賀菌侵入上皮細(xì)胞和尿路致病性大腸桿菌侵入膀胱上

7、皮細(xì)胞。
　　本項目為了弄清中國隱球菌腦膜炎的發(fā)病情況，回顧了國內(nèi)近三十年的病例報告，對中國人隱球菌腦膜炎的臨床特點和流行病學(xué)特征進(jìn)行了分析。同時，采用新生隱球菌野生株B4500FO2、cps1敲除株TYCC645和cps1回補(bǔ)株P(guān)CIP-39，感染人肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549單層，通過檢測新生隱球菌對人肺泡上皮細(xì)胞的粘附侵襲率、細(xì)胞表面CD44受體表達(dá)、細(xì)胞骨架改變，以及CD44受體抑制劑和Src激酶抑制劑對新生隱球菌侵襲A549細(xì)

8、胞的抑制作用，探討CD44/脂筏-Src激酶信號通路介導(dǎo)新生隱球菌侵入人肺泡上皮細(xì)胞的機(jī)制。
　　目的:
　　分析中國人隱球菌腦膜炎的流行特征，探討CD44/脂筏-Src激酶信號通路介導(dǎo)新生隱球菌侵入人肺泡上皮細(xì)胞的機(jī)制，尋找阻斷新生隱球菌侵入肺-血屏障的作用靶點，為隱球菌腦膜炎的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、中國大陸地區(qū)隱球菌腦膜炎流行病學(xué)分析
　　全面檢索中國知網(wǎng)、萬方、維普數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)

9、庫，收集1981年1月至2013年12月期間國內(nèi)期刊報道的隱球菌腦膜炎病例文獻(xiàn)。隱球菌腦膜炎病例的定義是:腦脊液隱球菌墨汁染色陽性;或新生隱球菌培養(yǎng)陽性;或新生隱球菌抗原檢測陽性。閱讀全文根據(jù)納入及剔除標(biāo)準(zhǔn)確定入選文獻(xiàn)。仔細(xì)閱讀入選文獻(xiàn)，記錄每篇文獻(xiàn)報道患者的性別、年齡、職業(yè)情況、接觸史、基礎(chǔ)疾病、發(fā)病時間、起病情況、實驗室檢查、治療、預(yù)后等情況分別進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
　　2、免疫熒光法檢測新生隱球菌感染后人肺泡上皮A549細(xì)胞骨

10、架的改變
　　可拆卸細(xì)胞培養(yǎng)八孔板用膠原蛋白collagen包被半小時，每孔接種104A549細(xì)胞，長成單層備用，然后將準(zhǔn)備好的105新生隱球菌野生株B4500FO2和cps1突變株TYCC645＃32加到細(xì)胞單層，并設(shè)置一組空白對照，37℃共同孵育3小時，冰的PBS洗3次，4％多聚甲醛固定，5％BSA封閉，然后在相應(yīng)孔中加入Rhodamine標(biāo)記的phalloidin(Sigma，1∶300)4℃作用lh，冰的PBS洗滌后，最后

11、每孔加入一滴含染細(xì)胞核的DAPI的抗熒光淬滅劑(Sigma)，封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1、中國大陸地區(qū)隱球菌腦膜炎流行特征
　　在中國知網(wǎng)、萬方、維普數(shù)據(jù)庫中共檢索到隱球菌腦膜炎相關(guān)文獻(xiàn)561篇，經(jīng)篩選剔除255篇，入選文獻(xiàn)306篇。結(jié)果男性發(fā)病比女性多，職業(yè)顯示農(nóng)民和工人發(fā)病較多?；A(chǔ)疾病情況:HIV1353例(21％)，其他基礎(chǔ)疾病2532例(39％)，無基礎(chǔ)疾病2629例(40％)，具體基礎(chǔ)疾

12、病依次為HIV/AIDS、結(jié)核、肝病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病等。主要癥狀以頭痛、發(fā)熱、腦膜刺激征為主。腦脊液檢查以壓力增高、白細(xì)胞增高、蛋白增高，糖降低、氯降低為主，HIV相關(guān)隱球菌腦膜炎患者CD4細(xì)胞小于50/ul個的占48.68％。
　　2、新生隱球菌感染導(dǎo)致A549細(xì)胞骨架重排
　　將新生隱球菌感染A549細(xì)胞后，用紅色熒光Rhodamine標(biāo)記的phalloidin染色細(xì)胞骨架肌動蛋白actin，熒光顯微鏡觀察。結(jié)果

13、發(fā)現(xiàn)野生株感染組A549細(xì)胞肌動蛋白紋理紊亂，稀疏，集中在膜上，膜上有毛刺樣突出;cps1突變株感染組改變程度明顯弱于野生株組;正常A549細(xì)胞對照組肌動蛋白分布均勻，紋理清晰。
　　3、莢膜透明質(zhì)酸HA在新生隱球菌粘附和侵襲A549細(xì)胞中發(fā)揮重要作用
　　野生株、cps1突變株、cps1回補(bǔ)株感染A549細(xì)胞1、3、5小時后，野生株粘附率分別是0.062±0.0025％、0.08±0.0020％、0.05±0.01040％

14、，突變株粘附率分別是0.012±0.0017％、0.029±0.0037％、0.036±0.0028％，回補(bǔ)株粘附率分別是0.032±0.0030％、0.039±0.0040％、0.026±0.0041％。野生株相對應(yīng)時間的粘附率均大于突變株，回補(bǔ)株粘附率也比突變株有所上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　本項目通過文獻(xiàn)病例回顧，分析中國人隱球菌腦膜炎的流行特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在中國，僅21％隱球菌腦膜炎與H

15、IV/AIDS相關(guān)。79％隱球菌腦膜炎發(fā)生在非HIV/AIDS患者。大部分隱球菌腦膜炎患者有基礎(chǔ)疾病，基礎(chǔ)疾病中以艾滋病感染為主;其他依次是結(jié)核，肝臟疾病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，糖尿病，腎臟疾病，肺部感染，惡性腫瘤等等，這些疾病多伴隨免疫功能的降低。結(jié)果證明，隱球菌腦膜炎的發(fā)生和免疫缺陷存在著一定聯(lián)系，盡管40％的患者沒有明確的基礎(chǔ)疾病。在中國，常用兩性霉素B+5-氟胞嘧啶、兩性霉素B+氟康唑、兩性霉素B+5-氟胞嘧啶+氟康唑聯(lián)合應(yīng)用治療隱球

16、菌腦膜炎，均獲得較好的效果。
　　我們的研究發(fā)現(xiàn):新生隱球菌感染可導(dǎo)致人肺泡上皮細(xì)胞A549細(xì)胞骨架重排，導(dǎo)致隱球菌內(nèi)吞;隱球菌野生株對A549細(xì)胞的粘附和侵襲率明顯高于cps1突變株;HA酶處理后，野生株對A549細(xì)胞的黏附侵襲率明顯下降，表明莢膜HA影響新生隱球菌對A549細(xì)胞的粘附和侵襲。
　　新生隱球菌感染的人肺泡上皮細(xì)胞A549表達(dá)CD44蛋白，該菌感染的小鼠肺組織也表達(dá)CD44，表明CD44可能參與該菌穿過肺-血

17、屏障的過程。尿胰蛋白酶抑制劑Bikunin可與CD44偶聯(lián)阻止CD44聚合，從而阻斷CD44信號通路。我們用CD44抑制劑Bikunin處理A549細(xì)胞后，再用隱球菌野生株或突變株感染細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生株對A549細(xì)胞的粘附和侵襲率明顯下降，而突變株因無HA其粘附和侵襲率無明顯改變，證明新生隱球菌莢膜HA和A549細(xì)胞上CD44受體參與粘附和侵入細(xì)胞。
　　Src激酶抑制劑PP2抑制新生隱球菌對A549細(xì)胞的粘附和侵襲，表明CD4