Tsi1-Tse1蛋白質(zhì)復合物結(jié)構(gòu)解析及過氧化氫與兩種蛋白質(zhì)的作用機制研究.pdf

1、作為生物體中的一種最重要的生物大分子，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學的一個至關(guān)重要的研究課題。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)、運動及其相互作用共同決定了蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子的生物學功能。蛋白質(zhì)的各級結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，以及同種或者不同種蛋白質(zhì)分子之間的相互作用的規(guī)律研究對于理解生命過程是極具價值的。蛋白質(zhì)與各種生物大分子間的相互作用決定了生物體內(nèi)諸多與個體發(fā)展以及細胞交流密切相關(guān)的生物過程，包括復制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯、轉(zhuǎn)移、細胞凋亡和其他信號通路。<

2、br>　　論文第一章詳細介紹了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其相互作用研究的現(xiàn)狀和方法，在文獻綜述的基礎上比較了各種研究方法的優(yōu)缺點及適用對象，并闡述了借助蛋白質(zhì)氧化標記進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的基本原理。
　　論文第二章介紹了細菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)的生物組成和功能，以及本論文的研究目標Tse1蛋白，Tsi1蛋白，Tsi1-Tse1復合物的結(jié)構(gòu)和功能。采用·OH標記從銅綠假單胞菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)中提取的Tse1效應蛋白和與其對應的免疫蛋白Tsi1蛋白以及Tsi1-

3、Tse1復合物，進而解析Tse1蛋白與Tsi1蛋白間的作用界面。具體的實驗路線為:(1)將Tse1效應蛋白，Tsi1免疫蛋白和Tsi1-Tse1復合物溶液同時置于γ射線照射環(huán)境中，水分子分解生成·OH，借以標記三種蛋白質(zhì);(2)采用LC-MS分析技術(shù)定性、定量地檢測氧化標記前后同一個多肽在Tse1蛋白，Tsi1蛋白以及Tsi1-Tse1復合物中的氧化標記程度。如果在照射后，某個肽段在復合物中的氧化標記程度小于其在單體中的氧化標記程度，則

4、認為該肽段有可能位于Tsi1和Tse1的作用界面上。實驗結(jié)果表明，多肽(49-68)DNCSGFVQSVAAELGVPMPR,(109-123) TYGHVAVVISGPLYR,(126-145)YPMCWCGSIAGAVGQSQGLK，(159-173) LNYYVYSLASCSLPR在復合物Tsi1-Tse1中的氧化程度明顯低于其在Tse1蛋白中的氧化標記程度。因此，猜測Tse1中的這四個多肽可能位于Tsi1和Tse1的結(jié)合部位。多

5、肽(63-71)IEDGGIWSR,(83-104) LMHEFSGSSAELVSYDSATCK和(116-120) WAVDK以及(144-153) SLAPFCQTAK在復合物Tsi1-Tse1中的氧化標記程度低于其在Tsi1中的氧化標記程度。因此，這四個多肽片段可能位于Tsi1和Tse1的結(jié)合部位。
　　論文第三章利用經(jīng)典的光譜學方法（熒光光譜、同步熒光光譜、紫外可見光譜、圓二色譜等）以及分子模擬軟件，從分子水平上研究了過氧

6、化氫(H2O2)與胰蛋白酶的相互作用機制，并分析了H2O2對胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能影響。結(jié)合常數(shù)和熒光壽命實驗結(jié)果共同表明，H2O2使胰蛋白酶發(fā)生了靜態(tài)猝滅。熱力學參數(shù)焓變和熵變數(shù)值均小于零，說明氫鍵作用和范德華力是復合物生成過程中的主要作用力。紫外吸收光譜、熒光光譜、同步熒光光譜和三維熒光光譜的結(jié)果共同表明，H2O2與胰蛋白酶的結(jié)合改變了胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)和色氨酸的微環(huán)境。因H2O2的加入，胰蛋白酶的α螺旋百分比從4.5％增加到5.7％，而

7、β折疊含量從45.4％減少到42.8％。但是，H2O2與胰蛋白酶的作用位點離胰蛋白酶的活性中心較遠，因此胰蛋白酶的活性未發(fā)生明顯的改變。
　　論文第四章對比研究了H2O2與人血清白蛋白的作用機制。整體來說，H2O2與這兩種不同類型的蛋白質(zhì)的結(jié)合存在諸多相似之處，但又因胰蛋白酶和血清白蛋白的特殊性存在差異。實驗結(jié)果表明，H2O2引起的HSA的熒光猝滅作用仍屬于靜態(tài)猝滅，二者之間的結(jié)合符合1∶1結(jié)合模式。熱力學參數(shù)表明，氫鍵作用和范德