豬溶血素在宿主腦膜炎和中毒性休克綜合癥過(guò)程中的作用機(jī)制研究.pdf

1、豬鏈球菌被認(rèn)為是一種重要的人畜共患病的病原菌。自1968年首次在丹麥發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了人感染豬鏈球菌的病例后，四百多例豬鏈球菌散發(fā)感染在隨后的四十多年中被陸續(xù)的報(bào)道出來(lái)，并且大部分的臨床病癥包括敗血癥，腦膜炎，心內(nèi)膜炎，關(guān)節(jié)炎，肺炎等。腦膜炎患者在這些患者中的比例占到了70％以上，并且造成了一些死亡案例。之前中國(guó)兩次大規(guī)模的豬鏈球菌疫情（1998年在江蘇和2005年在四川）的爆發(fā)造成了兩百多人的感染和53人死亡，幾乎全部的死亡病例所表現(xiàn)出的癥

2、狀為鏈球菌中毒性休克綜合癥。因此，對(duì)豬鏈球菌造成的這兩種主要疾病的理解，有助于我們應(yīng)對(duì)隨時(shí)可能爆發(fā)的大規(guī)模的豬鏈球菌疫情并且有助于我們對(duì)持續(xù)不斷的散發(fā)病例的防控與治療。
　　豬鏈球菌從最開始的感染到最后的致病，是多步驟的、復(fù)雜的，并且各種不同的毒力因子在不同的時(shí)空上發(fā)揮相應(yīng)的作用。關(guān)于腦膜炎，因?yàn)橹暗难芯考性谪i鏈球菌與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，以及豬鏈球菌引起腦實(shí)質(zhì)的炎癥反應(yīng)上，所以我們的研究重點(diǎn)關(guān)注豬鏈球菌是如何穿過(guò)血腦屏

3、障的這一問(wèn)題，確認(rèn)豬溶血素是否有助于豬鏈球菌穿過(guò)單層的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞組成的屏障；關(guān)于中毒性休克綜合癥，我們沒有像之前的研究一樣，把關(guān)注點(diǎn)放在爆發(fā)疫情的菌株新出現(xiàn)的89K毒力島上，而是發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌引起的中毒性休克綜合癥最主要的臨床特征和血管滲漏有關(guān)，并且通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研以及病人血清中肝素結(jié)合蛋白含量的測(cè)量，確認(rèn)豬鏈球菌引起的血管滲漏與肝素結(jié)合蛋白有關(guān)，并且在豬鏈球菌中豬溶血素被確認(rèn)是引起中性粒細(xì)胞釋放肝素結(jié)合蛋白最主要的因素，本研究的關(guān)注

4、點(diǎn)在于豬溶血素是通過(guò)什么樣的機(jī)制引起肝素結(jié)合蛋白從中性粒細(xì)胞中釋放并試圖通過(guò)動(dòng)物模型確認(rèn)關(guān)鍵分子的作用。因而本論文從如下兩個(gè)部分探討豬溶血素在豬鏈球菌導(dǎo)致的兩種主要疾病發(fā)病過(guò)程中的作用：
　　在第一部分的研究中，為了驗(yàn)證豬鏈球菌是否能借助中性粒細(xì)胞的“改良的特洛伊木馬”模型穿過(guò)血腦屏障，我們首先通過(guò)實(shí)時(shí)定量和酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)細(xì)菌和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用后細(xì)胞因子的基因水平和蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)由豬鏈球菌野生株05ZYH33敲除sly基

5、因獲得的Δsly敲除株不再能像野生株一樣刺激細(xì)胞因子兩種水平的表達(dá)，因而確認(rèn)了豬溶血素是豬鏈球菌促使人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的最主要毒力因子；接下來(lái)我們通過(guò)中性粒細(xì)胞穿過(guò)單層內(nèi)皮屏障的體外transwell模型和感染豬鏈球菌的CD1小鼠大腦病理切片證實(shí)豬溶血素有助于中性粒細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障到達(dá)腦組織，但豬鏈球菌野生株和敲除株在CD1小鼠血液和腦中的計(jì)數(shù)沒有差異提示中性粒細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障的過(guò)程中并沒有通過(guò)“改進(jìn)的特洛伊木馬”模型幫助豬

6、鏈球菌穿過(guò)血腦屏障。因此，豬鏈球菌在致腦膜炎的過(guò)程中，豬溶血素有助于中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等腦部炎癥的發(fā)展，但并沒有幫助豬鏈球菌穿過(guò)血腦屏障。
　　在第二部分的研究中，為了確認(rèn)豬溶血素引起中性粒細(xì)胞釋放肝素結(jié)合蛋白的具體機(jī)制，我們通過(guò)流式的方法檢測(cè)了豬溶血素刺激后中性粒細(xì)胞表面脫顆粒標(biāo)志物的表達(dá)并通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)了中性粒細(xì)胞顆粒內(nèi)含物的釋放，確認(rèn)豬溶血素通過(guò)引起中性粒細(xì)胞脫顆粒的方式而非直接裂解細(xì)胞來(lái)釋放肝素結(jié)合蛋白；接下來(lái)通過(guò)激光

7、共聚焦檢測(cè)中性粒細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量，我們解釋了由豬溶血素引起的中性粒細(xì)胞的肝素結(jié)合蛋白的釋放是鈣離子內(nèi)流依賴性的；利用抑制劑途徑的分析方式，我們認(rèn)為豬溶血素會(huì)與中性粒細(xì)胞表面的 TLR4受體結(jié)合，并激活下游p38 MAPK的磷酸化，從而激活核轉(zhuǎn)錄因子并促進(jìn)ALOX5 mRNA的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄合成5-脂加氧酶；5-脂加氧酶可以催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為白三烯A4，經(jīng)水解酶作用合成白三烯B4并分泌到細(xì)胞外；白三烯B4與中性粒細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體BL

8、T1結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K通路從而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞內(nèi)的顆粒物向細(xì)胞膜表面移動(dòng)，釋放肝素結(jié)合蛋白；通過(guò)構(gòu)建小鼠局部皮膚滲漏的Miles Assay模型，我們確認(rèn)了豬溶血素能在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中引起小鼠的血管滲漏。5-脂加氧酶的抑制劑Zileuton能顯著的降低由豬溶血素引起的肝素結(jié)合蛋白的釋放和小鼠的血管滲漏，證實(shí)了5-脂加氧酶在上述過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。我們的研究不僅闡釋了由豬溶血素導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞肝素結(jié)合蛋白的釋放并引起血管滲漏的機(jī)制，豐富