PHF8-H3K9me2-BDNF通路在鋁致突觸可塑性損傷中的作用研究.pdf

1、目的：
　?。?）探究慢性鋁暴露經(jīng)PHF8-H3K9me2-BDNF通路對大鼠海馬長時程增強(LTP)的影響；
　?。?）探討染鋁對人源性神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）中P HF8-H3K9me2-BDNF通路的影響。
　　方法：
　　1.動物體內(nèi)實驗研究：1）160只雄性SD大鼠，分別染毒3、6、9、12個月，共計四批，每一批大鼠40只，并按體重隨機分為對照和72、12、2mg/kg4個劑量組，每日經(jīng)飲水途

2、徑建立鋁染毒模型；2）電生理學(xué)方法檢測大鼠在體海馬LTP；3）ELISA法檢測大鼠海馬PHF8酶活性；RT-PCR法測定PHF8的mRNA的表達；4）Western-blot法測定PHF8、H3K9me2、BDNF的蛋白表達量。
　　2.體外實驗研究：1）培養(yǎng)SH-SY5Y細胞并用三氯化鋁進行染毒，實驗分組為分別為空白對照，1mMAl3+，2mMAl3+，4mMAl3+4個劑量組，染毒48小時后測定各項指標(biāo)；2）CCK-8法測定細

3、胞活力；ELISA法檢測細胞PHF8酶活性；RT-PCR法測定PHF8的mRNA的表達；3）Western-blot方法測定PHF8、H3K9me2、BDNF的蛋白表達量。
　　結(jié)果：
　　1、體內(nèi)實驗：（1）電生理學(xué)方法檢測大鼠在體海馬LTP：染毒時間與劑量間存在交互效應(yīng)。各批次內(nèi)不同劑量大鼠海馬標(biāo)化的fEPSP振幅差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且隨著染毒劑量的增大，標(biāo)化的fEPSP振幅呈逐漸下降趨勢。對照、低、中劑量組內(nèi)不同批次標(biāo)化

4、fEPSP幅度差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而高劑量組內(nèi)不同次標(biāo)化批次fEPSP幅度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。（2）ELISA法測定大鼠海馬H3K9去甲基化酶活性：染毒時間和劑量間無交互作用，不同劑量組大鼠海馬H3K9去甲基化酶酶活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且與對照組相比，中、高劑量酶活性分別降低了24.07％和33.62%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在不同批次間比較，發(fā)現(xiàn)隨著染毒時間的延長，大鼠海馬H3K9去甲基化酶酶活性呈逐漸下降趨勢，各批次間酶活性比較差異有統(tǒng)計學(xué)

5、意義，其中，與染毒3個月相比，9、12個月大鼠海馬H3K9去甲基化酶酶活性分別降低了15.77%，15.23%。（3）RT-PCR法測定PHF8的基因表達情況：四個批次大鼠海馬內(nèi)PHF8基因表達，染毒時間與劑量間無交互效應(yīng)。PHF8基因在各劑量組間和各批次間的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。（4）Western-blot方法測定PHF8、H3K9me2、BDNF的蛋白表達情況：1）PHF8表達量的改變：染毒時間和劑量間存在交互效應(yīng)（P<0.05

6、）。在四個批次內(nèi)，各劑量組間PHF8表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且各批次內(nèi)高劑量組PHF8蛋白表達量與對照組比分別下降了22.90%，28.02%，24.22%，27.14%。進一步分析同一劑量不同批次間蛋白表達量改變，發(fā)現(xiàn)只有在高劑量組內(nèi)，隨著染毒時間的延長，PHF8表達量逐漸下降，且不同批次間大鼠海馬PHF8表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義；2）H3K9me2，BDNF表達量的改變：染毒時間和劑量間不存在交互效應(yīng)。分別分析染毒劑量和時間對大鼠海馬

7、H3K9me2、BDNF表達量的影響：各劑量組蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且隨著染毒劑量的增加，H3K9me2表達量增加而BDNF表達量下降。其中，中、高劑量組H3K9me2表達量與對照組相比分別增加了13.00%，27.55%；與低劑量組比分別增加了12.12%，26.26%。，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；而與對照組比，中、高劑量組大鼠海馬BDNF表達量分別降低了20.88%和30.10%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與低劑量組比，中、高劑量組大鼠海馬B

8、DNF表達量分別降低了8.86%和17.70%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各批次間H3K9me2、BDNF表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且隨著染毒時間的增加H3K9me2表達量增加而BDNF表達量降低。其中12個月H3K9me2表達量與3、6個月相比均增加了10.34%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而9、12個月的BDNF的表達量與3個月相比，下降了9.75%，14.63%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.體外實驗：(1) CCK-8細胞活力測試：各染毒組

9、細胞活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與對照組比，2、4mM Al3+染毒組細胞活力分別下降了23%和32%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(2) ELISA法測定細胞核內(nèi)PHF8活性：各劑量組細胞H3K9去甲基化酶活性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，酶活性隨著染毒劑量的增加而下降。高劑量組酶活性下降最為明顯，與對照、低、中劑量組相比分別下降了24.87%，24.47%、16.06%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。（4）RT-PCR法測定PHF8基因表達量:各劑量組細胞PHF8基

10、因表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。（4）Western-blot法測定PHF8、H3K9me2、BDNF的蛋白表達情況：各劑量組PHF8、H3K9me2、BDNF蛋白表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義。且隨著染毒劑量的增加，PHF8和BDNF表達量呈下降趨勢，而H3K9me2表達量呈上升趨勢。與對照組相比，中、高劑量組PHF8表達量分別降低了11.20%，21.10%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與低劑量組比，高劑量組PHF8表達量降低了20.45%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

11、。與對照、低劑量組相比，高劑量組H3K9me2表達量分別增加了20.59%，14.71%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照、低劑量組相比，高劑量組BDNF表達量分別降低了20.68%，13.75%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.慢性飲水染鋁可對大鼠海馬LTP產(chǎn)生抑制作用，并且隨著鋁暴露時間的延長和劑量的增加，損傷趨于加重；
　　2.慢性飲水染鋁呈可致PHF8酶活性受到抑制且蛋白表達減少、H3K9me2蛋白表達增加、B