G-CSF動員后CD4+T細胞S1P-S1P受體信號變化及S1P5在LFA-1粘附功能中的作用.pdf

1、目的：粒細胞集落刺激因子(G-CSF)具有免疫調節(jié)作用。淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)不僅介導細胞間粘附,還可影響淋巴細胞免疫功能。1磷酸鞘氨醇(S1P)既可以作為胞內第二信使,又可以作為細胞間信號分子通過與受體結合而發(fā)揮作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)G-CSF動員后CD4+T細胞LFA-1粘附力下降,并使CD4+T細胞免疫功能改變,可能影響急性移植物抗宿主病的發(fā)生；G-CSF動員不改變供者血清的S1P濃度,但增強單核細胞內S1P限速酶S

2、phK的活性。結合文獻報道S1P可以增強LFA-1的粘附力,S1P拮抗劑通過LFA-1和β7整合素增加淋巴細胞歸巢。因此,我們推斷動員后S1P/S1P受體信號可能也參與了G-CSF免疫調節(jié)網(wǎng)絡。本研究通過分析G-CSF動員前后S1P/S1P受體信號的變化,S1P5對LFA-1粘附功能的影響以及CD4+T細胞G-CSF受體表達情況,研究探討S1P/S1P受體信號在G-CSF誘導免疫耐受中的作用。
　　 方法：⑴采用Realtime

3、 RT-PCR和流式細胞術檢測G-CSF動員前后S1P受體在mRNA和蛋白水平的表達變化；采用Transwell趨化實驗檢測G-CSF動員前后CD4+T細胞對S1P趨化作用的變化；采用粘附實驗檢測S1P對動員后CD4+T細胞LFA-1粘附能力的影響；采用Western blot的方法檢測G-CSF動員前后CD4+T細胞LFA-1磷酸化狀態(tài)的變化。⑵在Jurkat細胞系中,用洛伐他汀抑制LFA-1信號,用CCK-8法檢測抑制LFA-1后細

4、胞增殖,PI和AnnexinⅤ檢測細胞凋亡,用Realtime RT-PCR檢測S1P5表達變化；采用SiRNA轉染沉默Jurkat細胞S1P5,觀察S1P5對Jurkat細胞增殖、凋亡以及對LFA-1磷酸化和粘附能力的影響。⑶為研究G-CSF是否可直接通過受體調節(jié)CD4+T細胞功能,我們采用刀豆蛋白誘導CD4+T細胞活化,用流式細胞術檢測動員前后G-CSF受體的表達變化；CCK-8法檢測體外G-CSF對CD4+T細胞及Jurkat細胞

5、增殖的影響。
　　 結果：①G-CSF動員后CD4+T細胞的5種S1P受體,在mRNA水平上,S1P5表達較動員前上調,S1P1-S1P4表達無明顯差異；在蛋白水平上,S1P5在動員后CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞中表達均上調,其中CD4+T細胞變化幅度最大；動員后CD4+T細胞對S1P的遷移率較動員前下降；S1P不影響動員前CD4+T細胞LFA-1粘附率,但可降低動員后的CD4+T細胞LFA-1粘附率；G-CSF動員

6、后CD4+T細胞LFA-1磷酸化降低。②抑制LFA-1可抑制細胞系Jurkat和K562細胞增殖、誘導凋亡,并減少Jurkat細胞S1P5的表達。沉默Jurkat細胞S1P5基因后,對Jurkat細胞增殖、凋亡以及LFA-1磷酸化均無明顯影響,但可促進LFA-1粘附能力。③供者CD4+T細胞在動員前后均有G-CSF受體mRNA表達；G-CSF動員可抑制CD4+T細胞G-CSF受體表達；G-CSF體內、體外均可抑制刀豆蛋白誘導的CD4+T