氯乙烯亞慢性染毒對(duì)大鼠肝組織和外周血周期相關(guān)microRNAs表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　檢測(cè)氯乙烯染毒大鼠肝組織中周期相關(guān) miRNAs（mir-122、mir-125b、mir-192、mir-195、mir-21）表達(dá)的改變，探討其在肝細(xì)胞周期改變中的作用；同時(shí)檢測(cè)血清中相應(yīng)miRNAs的表達(dá)，為氯乙烯暴露早期標(biāo)志物的研究提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.動(dòng)物處理：按體重將96只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為三個(gè)染毒組（5mg/kg組、25mg/kg組和125mg/kg組）和對(duì)照組，每組24只

2、。采用腹腔注射相應(yīng)體積的氯乙烯氣體進(jìn)行染毒，對(duì)照組注射25mg/kg清潔空氣,每周3次。分別于染毒第6周、8周、12周末，每組隨機(jī)選取8只大鼠收集肝組織和血液。
　　2.肝細(xì)胞周期檢測(cè)：新鮮肝組織約100mg制備細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的70％乙醇4℃過(guò)夜固定細(xì)胞，然后用400μlPI染液暗處染色30min（期間搖晃數(shù)次），最后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：將提取合格的RNA（肝組織提取＜200nt的小片段R

3、NA，血清中提取總RNA）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量（SYBR染料法）檢測(cè)不同染毒時(shí)間各 miRNAs的表達(dá)量。獲得每個(gè)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物Ct值，結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算各miRNAs相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)量。
　　4.統(tǒng)計(jì)方法：所有數(shù)據(jù)均使用spss19.0進(jìn)行整理和分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)；若方差齊，進(jìn)行單因素方差分析，若方差不齊，進(jìn)行秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)）；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。定量數(shù)據(jù)如服從正態(tài)

4、分布，則以x-±s表示；不服從正態(tài)分布，則以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠狀況：染毒期間，動(dòng)物狀況良好，沒(méi)有出現(xiàn)明顯中毒癥狀。
　　2.肝細(xì)胞周期檢測(cè)：第6周，125mg/kg組G0/G1期細(xì)胞百分比（75.61±9.10%）與對(duì)照組（66.83±9.30%）相比增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第8周，三個(gè)劑量組 G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞百分比與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0

5、.05）；第12周，125mg/kg組S期細(xì)胞百分比（10.03±3.58%）與對(duì)照組（5.79±2.55%）相比增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.肝組織中 miRNAs的表達(dá)：5種 miRNAs的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。隨著染毒劑量的增加：第6周，各miRNAs的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05）；第8周，mir-125b、mir-21的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05）；第12周，各 mi

6、RNAs的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)：對(duì)照組和5mg/kg組，各miRNAs的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)顯著性（P＞0.05）；25mg/kg組和125mg/kg組，各miRNAs的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），且125mg/kg組下調(diào)更明顯，但25mg/kg組mir-195的相對(duì)表達(dá)量各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。從染毒第8周開(kāi)始，各miRNAs在25mg/kg組和125mg/kg組的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組

7、(5mg/kg組與對(duì)照組相比表達(dá)略增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，且隨著劑量的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)下調(diào)更加明顯。
　　4.血清中miRNAs的表達(dá)：mir-122、mir-125b、mir-21的相對(duì)表達(dá)量均不顯示顯著的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。mir-192相對(duì)表達(dá)量有顯著的時(shí)間效應(yīng)（P＜0.05），表現(xiàn)為先增加后降低，但兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；mir-195相對(duì)表達(dá)量有顯著的時(shí)間效應(yīng)（P＜0.05），表現(xiàn)為先降低后增加，但兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

8、。
　　5.肝組織和血清中miRNAs相關(guān)性分析：進(jìn)行肝組織和血清中表達(dá)的相關(guān)性分析，5種miRNAs均未發(fā)現(xiàn)有顯著相關(guān)性（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.氯乙烯破壞肝細(xì)胞G1/S關(guān)卡，使肝細(xì)胞短時(shí)間停滯于G1期，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞進(jìn)入S期的比例增加。
　　2.氯乙烯染毒6周，大鼠肝組織 miRNAs（mir-122、mir-125b、mir-192、mir-195、mir-21）表達(dá)上調(diào)，從第8周開(kāi)始下

9、調(diào)，并且到第12周時(shí)下調(diào)更加顯著。
　　3.肝組織miRNAs（mir-122、mir-125b、mir-192、mir-195、mir-21）表達(dá)量的變化可能與肝細(xì)胞周期G1/S關(guān)卡調(diào)控有關(guān)。
　　4.低豐度的miRNAs可能在氯乙烯致肝損傷中發(fā)揮重要作用。
　　5.在肝組織與血清中，miRNAs（mir-122、mir-125b、mir-192、mir-195和mir-21）表達(dá)量的變化不同。
　　6.血清m