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1、以市售大豆異黃酮粉為底物,采用從素食者糞便中分離得到的腸道菌LG-Q2,即鶉雞腸球菌(Enterococcus.gallinarum)為工作菌,對(duì)發(fā)酵代謝產(chǎn)物雌馬酚進(jìn)行制備與生物活性評(píng)價(jià)。采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)、響應(yīng)曲面法,在前期工作的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考查了工作菌的生長曲線、不同碳源對(duì)雌馬酚轉(zhuǎn)化力的影響,并優(yōu)化促進(jìn)雌馬酚轉(zhuǎn)化力的發(fā)酵條件。結(jié)果表明:生長規(guī)律為37℃厭氧條件下,培養(yǎng)6h后進(jìn)入指數(shù)期、24 h后進(jìn)入生長平穩(wěn)期、39 h后為衰
2、亡期,活菌數(shù)為1.34×108;葡萄糖為最適碳源,雌馬酚轉(zhuǎn)化能力最高為2.21μg/mg;最優(yōu)發(fā)酵條件:發(fā)酵液中葡萄糖濃度為5.00g/L,pH值7.02,NaCl濃度3.93g/L時(shí),雌馬酚轉(zhuǎn)化力最大預(yù)測(cè)值2.59μg/mg,驗(yàn)證試驗(yàn)實(shí)際測(cè)得的雌馬酚轉(zhuǎn)化能力為2.58μg/mg,二者差異不顯著,證明響應(yīng)模型成立,試驗(yàn)得到的最優(yōu)條件結(jié)果可靠。
向培養(yǎng)基中分別加入不同梯度濃度的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木聚糖和蔗糖等不同碳源,確定最
3、佳碳源種類,結(jié)果顯示,當(dāng)加入葡萄糖雌馬酚轉(zhuǎn)化力最高。以碳源、pH值和NaCl為單因素、雌馬酚轉(zhuǎn)化力為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過響應(yīng)曲面試驗(yàn)考察不同因素對(duì)腸道菌LG-Q2產(chǎn)雌馬酚能力的影響,確定腸道菌LG-Q2代謝大豆異黃酮的最佳條件。結(jié)果是響應(yīng)曲面試驗(yàn)中當(dāng)最佳條件為葡萄糖濃度5.00g/L,pH值7,NaCl濃度3.93g/L。
以發(fā)酵液為樣品,選用活性炭脫色、聚酰胺樹脂為吸附劑進(jìn)行純化處理,經(jīng)冷凍干燥制備雌馬酚。采用單因素正交試驗(yàn)考察脫
4、色時(shí)間、活性炭用量以及脫色溫度對(duì)脫色率的影響;優(yōu)化最佳脫色、純化條件,結(jié)果表明:對(duì)脫色率影響最大的因素為脫色時(shí)間,其次為脫色溫度、脫色劑量;當(dāng)脫色溫度50℃,脫色劑量2g,脫色的時(shí)間1.5h為最佳條件。之后對(duì)脫色后的樣液進(jìn)行雌馬酚純化,以(乙腈+甲醇+水)∶(3+4+3)洗脫劑用量、洗脫速率、聚酰胺樹脂吸附劑用量為單因素,雌馬酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化純化條件,結(jié)果表明:洗脫劑用量對(duì)雌馬酚濃度影響結(jié)果最大,其次為吸附劑量和洗脫速率
5、;洗脫劑用量40mL,洗脫速率0.6mL/min,吸附劑用量2g。采用優(yōu)化的條件參數(shù)及液相色譜法,發(fā)酵液雌馬酚轉(zhuǎn)化率為0.25%,相同方法做回收試驗(yàn),回收率為78.38%,樣品純度為38%。
灌胃方式對(duì)試驗(yàn)小鼠分別喂入,以雌馬酚樣品、雌馬酚標(biāo)品、大豆異黃酮保健品為受試物,設(shè)計(jì)不同試驗(yàn)組,徑口灌胃給雌雄小鼠,試驗(yàn)45天,每隔15天對(duì)小鼠眼眶處進(jìn)行取血后離心得血清,用試劑盒法測(cè)定小鼠血清中游離脂肪酸、高、低密度脂蛋白膽固醇、總蛋白
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