PI3K通路介導甲苯二異氰酸酯誘導的小鼠哮喘模型中肺部caspase-1激活和HMGB1產生.pdf

1、目的：
　　提出假設:1.在TDI誘導的哮喘小鼠模型中，PI3K信號通路介導肺組織HMGB1的產生。2.NLRP3炎癥體和caspase-1在這個過程中發(fā)揮作用。
　　內容：
　　第一部分:根據TDI哮喘的特點，參考課題組前期造模方式建立TDI誘導的哮喘小鼠模型;在此模型的基礎之上給予PI3K抑制劑LY294002干預（腹腔注射），觀察小鼠過敏性氣道炎癥的變化以及小鼠肺組織中HMGB1的變化情況。
　　第二部分:

2、給予PI3K抑制劑LY294002干預后，觀察TDI哮喘小鼠肺組織中NLRP3炎癥體是否有激活。
　　材料與方法：
　　6周齡的SPF級雄性BALB/c小鼠48只，體重為20-22 g（購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心）。丙酮、橄欖油、TDI、乙酰甲膽堿;LY294002; HE染液，PAS染液;DAB顯色試劑盒。小鼠IgE、白細胞介素-4(IL-4) ELISA試劑盒。HMGB1一抗、caspase-1、 IL-1β、NLRP

3、3一抗。
　　1.動物模型的制備
　　BALB/c小鼠在南方醫(yī)科大學實驗動物中心具有12小時明暗周期的SPF級別動物房飼養(yǎng)，所有實驗操作嚴格遵守南方醫(yī)科大學動物學科委員會管理規(guī)范。48只小鼠隨機分為4組:(1) AOO組（即對照組，用AOO致敏、AOO激發(fā)、PBS處理，其中AOO是TDI的溶劑）;(2) TDI組（即實驗組，用TDI致敏、TDI激發(fā)、PBS處理）;(3) TDI+LY294002組（即PI3K干預組，用TDI

4、致敏、TDI激發(fā)、LY294002處理）;(4) TDI+DMSO組（用TDI致敏、TDI激發(fā)、DMSO處理，其中DMSO是LY294002的溶劑）。AOO組:第1天、第8天致敏，具體方法:將丙酮和橄欖油的混合液（體積比為2∶3）20微升滴到小鼠耳背部，40 uL/只小鼠;第15天、第18天、第21天給予霧化吸入激發(fā)，具體方法:將小鼠放進霧化箱，用移液槍將丙酮橄欖油混合液（體積比為1∶4）放進壓縮空氣霧化裝置持續(xù)霧化2小時。每次激發(fā)前1

5、小時按50uL每只的劑量腹腔注射生理鹽水。TDI組:第1天、第8天致敏，具體方法:0.3％TDI20uL（丙酮和橄欖油體積比為2∶3）滴到小鼠耳背部，40uL/只小鼠;第15天、第18天、第21天給予霧化吸入激發(fā)，具體方法:將小鼠放進霧化箱，用槍將3％TDI（溶于體積比為1∶4的丙酮和橄欖油混合液）放進霧化裝置，持續(xù)霧化2小時。每次激發(fā)前1小時按50uL每只的劑量腹腔注射生理鹽水。TDI+LY294002組操作過程同TDI組，每次激發(fā)前

6、1小時按1.5mg/kg劑量腹腔注射LY294002（LY294002溶于DMSO，用0.9％ NaCl稀釋至50uL）。作為對照，TDI+DMSO組，與TDI+LY294002組操作過程同，每次激發(fā)前1小時腹腔注射等劑量的DMSO(DMSO用0.9％ NaCl稀釋至50uL)。
　　2.氣道高反應性檢測
　　小鼠氣道高反應性檢測于第3次激發(fā)結束后24h進行，簡要過程如下:將小鼠置于氣壓體積描記儀主倉內，用乙酰甲膽堿按遞增濃

7、度（濃度0-10mg/mL）加入霧化器，霧化后乙酰甲膽堿進入氣壓體積描記儀主倉，每個濃度霧化后檢測3min，同時觀察小鼠反應，BUXCO無創(chuàng)肺功能檢測儀記錄小鼠的氣道反應性指標Penh(enhanced pause)。
　　3.動物處死和取材
　　小鼠肺功能測量結束后24h，用致死量的戊巴比妥鈉（100 mg/kg體重）腹腔內注射麻醉處死小鼠，給予小鼠眼球摘除，取血，將全血靜置1h后，離心20分鐘，轉速3000轉/分，取上清

8、，-80℃保存?zhèn)溆谩⒚恐恍∈蟮念i部淋巴結分離摘除，予氣管插管，用縫線固定導管，行肺泡灌洗術:用0.8mL的預熱的生理鹽水(0.9％ NaCl，37℃)緩慢、輕柔地注入肺內，繼之回抽，重復3次，最后收集肺泡灌洗液于EP管內。然后，將導管插入左肺，往左肺注入4％福爾馬林中性緩沖液0.2mL行內固定，摘除左肺，置于4％福爾馬林中性緩沖液進行外固定，常溫保存，作以后病理切片備用;摘除右肺-80C保存，作以后免疫印跡備用。
　　4.淋巴細

9、胞培養(yǎng)及淋巴上清IL-4檢測
　　將上述摘除的各組小鼠頸部淋巴結分別放入1.5ml EP管，所有EP管均置于冰上，加入1.0mL RPMI-1640。將EP管中淋巴結轉移至40μm細胞篩上，眼科鑷輕輕擠壓，10mL RPMI-1640沖洗，15mL離心管收集沖洗液，取10uL沖洗液計數(shù)細胞，剩余沖洗液予1000轉/分，離心3分鐘，棄上清液，用RPMI-1640重懸至細胞濃度為107/ml，準備48孔板，每孔加入900uL全培養(yǎng)基（

10、RPMI-1640含10％FBS及5 mg/mL刀豆球蛋白A），將100uL的細胞懸液加入其中使得細胞濃度為106/mL。放置37℃培養(yǎng)箱43小時。培養(yǎng)結束后取培養(yǎng)液1000轉/分離心10分鐘，上清分裝，放置-80℃保存，用于檢測IL-4。
　　結果：
　　1.LY294002對TDI誘導的哮喘小鼠PI3K信號通路的影響
　　為確認PI3K抑制劑LY294002對PI3K信號通路的作用，我們檢測p-Akt, PI3K最

11、重要的下游分子。我們發(fā)現(xiàn)與AOO組相比，TDI組小鼠在TDI致敏和激發(fā)后，肺組織p-Akt的表達可顯著上調(p＜0.05)，而TDI+LY294002組中，LY294002預處理可顯著減輕TDI誘導的p-Akt表達上調(p＜0.05)。TDI+DMSO組p-Akt表達與TDI組相似，表明LY294002的溶媒DMSO本身并不影響p-Akt表達(p＞0.05)。
　　2.PI3K介導TDI誘導的哮喘小鼠氣道高反應性和過敏性氣道炎癥<

12、br>　　首先，PI3K介導TDI誘導的氣道高反應性。與AOO相比，在遞增濃度的乙酰甲膽堿(1.25、2.5、5、10mg/mL)刺激后，TDI組小鼠的Penh值顯著增加(p＜0.05)。所有這些改變在LY294002治療后部分恢復(p＜0.05)。再者，與AOO組相比，TDI組哮喘小鼠血清總IgE的釋放顯著增加(p＜0.05)，以及淋巴細胞上清培養(yǎng)液的IL-4明顯增加(p＜0.05)，而PI3K抑制劑LY294002預處理均可使兩者明

13、顯降低(p＜0.05)。
　　最后，我們評估小鼠肺泡灌洗液總細胞數(shù)，以及巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞分類計數(shù)。無論是總細胞數(shù)，還是中性粒細胞或嗜酸性粒細胞計數(shù)，均在TDI刺激后明顯增多(p＜0.05)。肺組織學檢查顯示出類似的結果，暴露于TDI的小鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)更多的炎癥細胞浸潤和顯著的上皮增殖。 LY294002同樣可以部分逆轉TDI誘導的BALF和肺組織中的這些改變(p＜0.05)。
　　3.PI3K參與

14、了肺組織HMGB1的生產及其核漿轉位
　　免疫印跡結果示:和上述氣道高反應性和過敏性氣道炎癥一致，肺組織HMGB1的蛋白表達水平在TDI組小鼠比AOO組顯著增高。通過免疫組織化學染色檢查小鼠肺組織切片也可獲得類似的結果:在AOO組，HMGB1幾乎只分布在肺組織各種細胞的細胞核，然而，3次TDI激發(fā)后，HMGB1從細胞核轉位到細胞漿，彌漫分布于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、氣道成纖維細胞和浸潤于肺組織的各種炎癥細胞。值得注意的是，在

15、PI3K抑制劑LY294002預處理后，無論是HMGB1在肺組織的高表達，還是其核漿轉位均在很大程度上得到減輕(p＜0.05)。
　　4.LY294002對肺組織caspase-1激活的影響
　　為進一步探討PI3K是通過什么機制調節(jié)TDI誘導的過敏性氣道反應過程中HMGB1生產和釋放，我們測量HMGB1最為人所公認的上游分子caspase-1。首先，使用免疫組織化學的方法，我們發(fā)現(xiàn)，TDI致敏和激發(fā)后，小鼠肺組織表達的ca

16、spase-1明顯增多，支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、各種炎癥細胞細胞漿內可見非常濃厚的caspase-1分布，同樣地，LY294002預處理大大減弱這種TDI誘導的caspase-1上調。然后，我們通過免疫印跡檢測caspase-1的前體procaspase-1(45KD)和成熟體caspase-1(20KD)在肺組織的蛋白質含量，可見:與AOO組相比，TDI組小鼠肺組織成熟體caspase-1(而不是前體procaspase-1)的

17、蛋白質水平顯著升高(p＜0.05)。這表明我們通過免疫組織化學染色觀察到的TDI誘導的caspase-1表達增加主要是由于成熟體caspase-1構成。我們進一步發(fā)現(xiàn)，這種增加的caspase-1表達在PI3K抑制劑LY294002預處理后明顯逆轉(p＜0.05)，而procaspase-1在各組小鼠肺組織的表達幾乎保持不變(p＞0.05)。這些數(shù)據表明，TDI誘發(fā)哮喘小鼠中肺組織caspase-1的激活，而PI3K活性是caspase