鍶對hMSCs增殖、分化的影響及含鍶脫鈣骨對hMSCs的作用.pdf

1、目的:觀察鍶(Sr)對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow derived mesenchymalstem cells,hMSCs)增殖與成骨分化的影響并探索其最佳作用濃度;制備不同含鍶量的脫鈣骨基質(zhì)(decalcified bone matrix,DBM),并與hMSCs復(fù)合,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后觀察hMSCs在不同含鍶量的脫鈣骨中的成骨效果。
　　 方法:
　　 1、抽取健康成年志愿者骨髓6ml,體外分離

2、、培養(yǎng)原代hMSCs,流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表型。取第4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),共分為5組,A組為空白對照,培養(yǎng)液中僅加入骨誘導(dǎo)劑(地塞米松10-8mol/L、抗壞血酸50μg/ml、β-甘油磷酸鈉10mmol/Lol/L),B、C、D、E組培養(yǎng)液在加入骨誘導(dǎo)劑后分別加入3.75×10-3、3.75×10-3、3.75×100-1、3.75mmol/L的氯化鍶(SrCl2)。定期測定各組hMSCs的增殖情況(MTT法)、堿性磷酸酶(alkaline

3、 phosphatase,ALP)活性(酶標(biāo)法)和骨鈣素(OCN)含量(放免法),并觀察細(xì)胞茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色情況,分析各組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量及面積。
　　 2、收集臨床髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后廢棄的股骨頭(外傷致股骨頸骨折,股骨頭無缺血性壞死),切成5mm×5mm×5mm的骨塊,以改良Urist法制作脫鈣骨基質(zhì)(DBM)。將Ⅰ型膠原溶液分別與不同濃度的SrCl2溶液混合,使鍶-膠原溶液中鍶的終濃度分別為:0、3.75×10-3、3.75×10-3

4、、3.75×10-1、3.75mmol/L,分別標(biāo)記為A’、B’、C’、D’、E’組。將制備的DBM浸入鍶-膠原混合溶液中1h,取出后以真空吸附法使鍶-膠原混合物充分吸附于材料表面,將材料取出,環(huán)氧乙烷滅菌備用。將培養(yǎng)的第4代hMSCs與各組含鍶的DBM復(fù)合培養(yǎng),定期測定各組hMSCs的殖增情況(MTT法)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性(酶標(biāo)法)和骨鈣素(OCN)含量(放免法)。
　　 結(jié)果

5、:
　　 1、隨培養(yǎng)時(shí)間增加,各組細(xì)胞增殖和成骨分化均明顯提高,有顯著差異(P＜0.01);同時(shí)間點(diǎn)比較中,第7天的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、第7、14天的ALP檢測、第14、21天的OCN檢測以及第21天的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量、面積定量檢測,B～E組均優(yōu)于A組并有顯著差異(P＜0.05)。第7天的MTT檢測及第14天的ALP檢測,D組均值最高,與A、B、C組有顯著差異(P＜0.05),與E組無顯著差異(P＞0.05);第21天的OCN檢測以及鈣結(jié)節(jié)

6、數(shù)量、面積定量檢測,D組均值最高,與其他4組均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 2、hMSCs與各組含鍶DBM復(fù)合培養(yǎng)后,隨培養(yǎng)時(shí)間增加,各組細(xì)胞增殖程度明顯提高,有顯著差異(P＜0.01);同時(shí)間點(diǎn)比較中,MTT:第1、4、7天各組間均無顯著性差異(P＞0.05);ALP:第7、14天各有顯著性差異(P＜0.01),含鍶組活性強(qiáng)于空白組,含鍶組間差異不明顯(P＞0.05);OCN:第7、14、21天,無顯著性差異(P＞0.