新型含鍶硫酸鈣的生物相容性試驗.pdf

1、在開放性骨折、良性或惡性骨腫瘤、脛骨平臺壓縮性骨折等骨科手術的處理過程中，骨科醫(yī)師經(jīng)常會遇到骨缺損這一難題。進行骨移植是解決這一問題的一項很常見的操作。自體骨移植是目前臨床上解決骨缺損問題的金標準。自體骨移植的特點是具有良好的骨誘導性、成骨特性及骨傳導性。如何使硫酸鈣在保留原有特性的同時又具有骨誘導性是近年來的研究熱點。鍶對骨的再生有益，它在促進成骨的同時又能抑制破骨，展現(xiàn)出了良好的骨誘導性[6]。摻鍶硫酸鈣的制備早有報道，但是之前的研

2、究為含鍶化合物與硫酸鈣的物理混合，無法保證產(chǎn)品在微觀水平的絕對均一性[7]。我們設想的實驗目的在于探討采用水熱法制備一種新型的摻鍶硫酸鈣可達到完全均質(zhì)性，并進行生物相容性檢測，滿足臨床需要。依據(jù)GB/T16886.1-2011[8]，我們選擇了遲發(fā)性超敏試驗、細胞毒性試驗、皮內(nèi)刺激試驗、急性全身毒性試驗、亞急性全身毒性試驗、肌肉內(nèi)植入試驗、紅細胞微核試驗共七項相關試驗進行生物相容性評估。
　　第一章 新型含鍶硫酸鈣的制備
　

3、　目的:制備一種新型的摻鍶硫酸鈣。
　　材料與方法:(1)共沉淀法制備含鍶的二水硫酸鈣
　　將含有氫氧化鈣和氫氧化鍶的化合物按9∶1的摩爾比進行混合，加入去離子水制成水溶液，然后將含混合液的燒杯放置于磁力攪拌器上，再將稀硫酸加入前述混合液中，滴入過程中保持30℃加熱、持續(xù)攪拌，滴入完畢后維持加熱及攪拌3小時。生成的沉淀經(jīng)過濾、洗滌及干燥后，制成一定比例的含鍶二水硫酸鈣。方程式如下:
　　Ca(OH)2+H2SO4=Ca

4、SO4↓+2H2O Sr(OH)2+H2SO4=SrSO4↓+2H2O
　　(2)水熱法制備含鍶的α-半水硫酸鈣
　　將步驟1生成的產(chǎn)物按一定液固比與去離子水進行混合，利用水熱反應釜在一定溫度下反應6小時，后趁熱將沉淀進行過濾、洗滌、干燥及球磨，即制得含鍶α-半水硫酸鈣。結(jié)果評價:制得粉末進行X線衍射、傅里葉變換紅外光譜及差式量熱掃描表征檢測，證明所制備產(chǎn)物為含鍶α-半水硫酸鈣。
　　結(jié)果:X線衍射結(jié)果示:于14.63

5、°，25.72°和29.80°處可見α-半水硫酸鈣的特征三強峰，而在24.78°處可見鍶元素的特征峰;傅里葉變換紅外光譜與α-半水硫酸鈣標準圖譜相似，說明制備過程中鍶元素的加入并未影響α-半水硫酸鈣特有的性質(zhì)。差式量熱掃描結(jié)果，制備材料中結(jié)構(gòu)水含量為6.03％，與單純α-半水硫酸鈣的6.20％相類似。如圖所示，于146.37℃處可見吸熱峰，而放熱峰位于174.64℃處，進一步證實了制備材料具備α-半水硫酸鈣的性質(zhì)。
　　結(jié)論:成功

6、制備了含鍶硫酸鈣。
　　第二章 皮內(nèi)刺激反應試驗
　　目的:評價被試材料是否有潛在急性毒性刺激反應。
　　材料與方法:在每只兔脊柱一側(cè)的5個點皮內(nèi)注射0.2mL用極性溶劑制備的浸提液。同樣在每只兔脊柱同一側(cè)的后五個點皮內(nèi)注射0.2mL極性溶劑對照液，在每只兔脊柱另一側(cè)注射用非極性溶劑制備的浸提液和非極性溶劑對照液，操作步驟同上。
　　結(jié)果:(1)極性浸提液組與極性溶劑對照組在24h、48h、72h三個時間點均未見

7、紅斑、水腫和潰瘍反應，原發(fā)性刺激評分為0。(2)非極性浸提液組與非極性溶劑對照組在三個時間點可見有紅斑，但浸提液組紅斑范圍并未超過溶劑對照組;同時兩組均未見水腫。
　　結(jié)論:可以認為該材料的皮內(nèi)刺激反應為陰性。
　　第三章 遲發(fā)型超敏反應試驗
　　目的:評價被試材料是否具有引發(fā)遲發(fā)型超敏反應的潛能。
　　材料與方法:本試驗采用最大劑量致敏試驗，試驗流程主要包括三個階段:皮內(nèi)誘導階段、局部誘導階段、激發(fā)階段。

8、>　　結(jié)果:根據(jù)Magnusson和Kligman評級標準，實驗組及對照組所用動物評級均為0級。
　　結(jié)論:該材料不會引起遲發(fā)型超敏反應。
　　第四章 體外細胞毒性試驗
　　目的:將浸提液加入L-929細胞中以評估其對細胞形態(tài)學改變及毒性。
　　材料和方法:試驗使用L929系細胞株（標準推薦），配制1×105/mL的L929細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種100μ L。置于培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2)培養(yǎng)24

9、小時，待細胞大部分貼壁后，棄原培養(yǎng)基，用PBS液洗滌2次。實驗組分別為100μ L的100％、75％、50％、25％浸提液，陰性對照組為100μL相應的對照液，陽性對照組為100μL的0.64％苯酚溶液，每組18個復孔。分別于培養(yǎng)24小時、48小時及72小時后取各組6孔進行MTT實驗。在各觀察期，棄去原培養(yǎng)液，然后加入MTT溶液20μL，37℃下繼續(xù)孵育4小時后終止培養(yǎng)，吸去上清液，每孔加入150μ L二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10m

10、in，用酶標儀在490nm波長下測定其光吸收值(A490)，每孔測量3次，取其平均值作為其吸光值結(jié)果。
　　結(jié)果:(1)各實驗組不同時間的細胞增殖率:隨著時間的增加，各實驗組A490呈現(xiàn)增大的趨勢，各實驗組與陰性對照組A490值比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(2)細胞毒性評價:實驗組、陰性對照組不同時間點的毒性反應均為Ⅰ級，無細胞毒性;而陽性對照組毒性反應均為Ⅳ級，有細胞毒性。
　　結(jié)論:在本次試驗條件下，被試材料的

11、細胞毒性試驗為無細胞毒性，符合國家標準。
　　第五章 急性全身毒性試驗
　　目的:評估該材料是否引起急性全身毒性。
　　材料與方法:取SPF昆明小鼠12只，雌雄各半，隨機分為實驗組和對照組，實驗組6只，對照組6只。腹部常規(guī)安爾碘消毒后，用一次性注射器分別向?qū)嶒灲M小鼠腹腔內(nèi)注50ml/kg體重劑量的浸提液一次，對照組小鼠注射50ml/kg體重劑量的生理鹽水一次。
　　結(jié)果:(1)在注射后當時實驗組、對照組所有動物均

12、未出現(xiàn)不適癥狀，實驗組與對照組無明顯差異。(2)所有小鼠體重都呈增加趨勢。對體重增加量進行統(tǒng)計學分析（t檢驗），可見三個時間點的P值均大于0.05。
　　結(jié)論:說明被試材料浸提液在短期內(nèi)無潛在毒性，可以認為該材料的急性全身毒性實驗符合實驗要求。
　　第六章 亞急性全身毒性試驗
　　目的:評估材料是否有潛在亞急性毒性反應。
　　材料與方法:取SPF級昆明小鼠20只，雌雄各半，隨機分為實驗組和對照組，實驗組10只，對

13、照組10只。腹部常規(guī)安爾碘消毒后，用一次性注射器分別向?qū)嶒灲M小鼠腹腔內(nèi)注50ml/kg體重劑量的浸提液一次，對照組小鼠注射50ml/kg體重劑量的生理鹽水一次。重復相同操作，連續(xù)注射14天。
　　結(jié)果:(1)體重變化結(jié)果:浸提液注射后，所有小鼠體重呈增加趨勢，與對照組小鼠體重的增長相比，無統(tǒng)計學差異。(2)臨床觀察方面，實驗組及對照組均未出現(xiàn)異常情況，無紅斑、水腫出現(xiàn)。(3)臨床病理學檢查結(jié)果:測定紅細胞數(shù)(RBC)、白細胞數(shù)(W

14、BC)、血小板數(shù)(PLT)、血紅蛋白濃度(HGB)、紅細胞壓積(HCT)和平均紅細胞體積(MCV)。實驗組與對照組雌、雄分別對比，所測六項指標均無統(tǒng)計學差異。測定天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、尿素氮(BUN)、總蛋白(TP)、血糖(GLU)、肌酐(CRE)、總膽固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)等血清生化學指標。實驗組與對照組雌、雄分別相比，所測定的八項生化指標均無統(tǒng)計學差異。(4)實驗組和對照組在器官體

15、重上無明顯差異。心、肝、脾、肺、腎的病理切片上未觀察到炎癥或組織壞死現(xiàn)象。
　　結(jié)論:五個方面的評價結(jié)果表明被試材料浸提液在長期反復接觸時不會引起全身毒性。
　　第七章 哺乳動物紅細胞微核實驗
　　目的:測試被試材料的潛在致突變性。
　　材料與方法:對實驗組及陰性對照組所有動物分別按20ml/kg腹腔注射被試材料浸提液、0.9％生理鹽水;陽性對照動物注射環(huán)磷酰胺溶液，注射劑量為40mg/kg體重。試驗時注意，每天

16、注射時，應使所有動物幾乎同步被注射。第二次染毒在第一次染毒后，間隔24小時再次染毒，注射劑量及方法同第一次染毒。
　　結(jié)果:(1)毒性表現(xiàn)觀察:實驗組及對照組動物在接受不同處理后呼吸、進食、尿便排泄等一般狀態(tài)正常，無嘔吐、驚厥、步態(tài)失穩(wěn)、呼吸抑制等中毒表現(xiàn)，所用動物均未死亡或垂死，未觀察到毒性表現(xiàn)。(2)實驗組嗜多染紅細胞在總紅細胞中比例不低于對照組的20％，符合實驗要求;(3)與陰性對照組相比，實驗組微核率差異無統(tǒng)計學意義，而陽

17、性對照組微核率差異有顯著性意義
　　結(jié)論:該實驗條件下被試材料的浸提液對小鼠不會產(chǎn)生遺傳毒性，即沒有致突變作用。
　　第八章 肌肉內(nèi)植入試驗
　　目的:植入后局部反應試驗是評價生物材料和制品對活體組織的局部毒性作用。
　　材料與方法:以2 ml/Kg注射量將3％戊巴比妥鈉溶液腹腔注射注射麻醉，在大鼠脊柱中線兩側(cè)約lcm處各選1個植入點，分離肌肉形成肌腔隙，植入被試材料（高10mm，直徑3 mm圓柱體），每側(cè)各植入

18、1個，右側(cè)植入實驗組（含鍶硫酸鈣），左側(cè)作為空白對照組（切開但不植入），術后動物連續(xù)3天肌注青霉素預防感染。
　　結(jié)果:(1)整個實驗過程中，沒有出現(xiàn)排斥反應和全身毒性反應，動物術后第二天就活動自如，觀察期內(nèi)無任一動物死亡。(2)術后1周，炎性細胞反應程度為Ⅳ級，囊壁形成0級;術后4周，炎性細胞反應程度為Ⅱ級，囊壁形成為Ⅱ級;術后12周，炎性細胞反應程度為Ⅰ級，囊壁形成為Ⅰ級。
　　結(jié)論:試驗系統(tǒng)下該材料不存在潛在肌肉毒性。