早期激素性股骨頭壞死差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析及相關(guān)蛋白表達(dá)驗(yàn)證.pdf

1、隨著激素在臨床上廣泛應(yīng)用，激素性股骨頭缺血性壞死(steroid-inducedavascularnecrosisoffemoralhead，SANFH)已居非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首位。目前SANFH的發(fā)病機(jī)制尚不明確，眾多發(fā)病學(xué)說往往僅從單一的分子或基因水平上對SANFH發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究，無法整體、動態(tài)、多層次地了解SANFH發(fā)生過程中相關(guān)調(diào)控基因和相關(guān)功能基因蛋白產(chǎn)物的種類、數(shù)量及峰值變化規(guī)律。隨著后基因組時(shí)代的來臨，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的

2、興起，為我們研究SANFH的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路及技術(shù)手段。
　　 目的：(1)通過反復(fù)大劑量注射地塞米松聯(lián)合增加股骨頭負(fù)重的方法建立兔早期SANFH模型，為后續(xù)比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供較為理想的動物模型。(2)優(yōu)化兔股骨頭蛋白質(zhì)組雙向電泳(2-DE)技術(shù)。(3)創(chuàng)建早期SANFH不同時(shí)點(diǎn)(注射激素后3w、6w、9w、12w)與正常股骨頭的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，經(jīng)圖像分析及質(zhì)譜鑒定后篩選出差異蛋白并觀察其變化規(guī)律。(4)對差異表達(dá)蛋白

3、Annexin A1進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，以證實(shí)2-DE結(jié)果的可靠性。
　　 方法：(1)健康成年新西蘭大白兔48只，隨機(jī)分為模型組和對照組。模型組臀肌注射地塞米松針(10mg/kg)，每次間隔48h，通過迫使兔子站立進(jìn)食水增加股骨頭負(fù)重，對照組相同時(shí)點(diǎn)注射等量生理鹽水。分別于給藥后3w，6w，9w，12w處死兔子，每次模型組和對照組各6只。觀察動物一般狀態(tài)、股骨頭外觀、病理學(xué)改變(包括骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞、骨小梁及骨細(xì)胞)及骨細(xì)胞Casp

4、ase-3活性變化情況。(2)用健康成年新西蘭大白兔股骨頭作為樣本，改進(jìn)2-DE程序中的幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對樣品制備(骨組織破碎、細(xì)胞裂解、除鹽)、等電聚焦程序、固相膠條的選擇和凝膠染色方法進(jìn)行一系列比較和優(yōu)化。(3)獲取SANFH早期病理變化過程的不同時(shí)間點(diǎn)(注射激素后3w、6w、9w、12w)及正常股骨頭壞死標(biāo)本，利用2-DE技術(shù)創(chuàng)建早期SANFH不同時(shí)點(diǎn)與正常股骨頭的蛋白表達(dá)圖譜，運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-

5、MS)對差異點(diǎn)進(jìn)行鑒定。(4)應(yīng)用免疫印跡(Western Blot)技術(shù)檢測Annexin A1在各組的表達(dá)水平，并與2-DE結(jié)果進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：(1)模型組給藥3w后可見骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞體積增大，數(shù)量增多，并且隨給藥時(shí)間的延長脂肪細(xì)胞肥大更為明顯，甚至發(fā)生融合，骨髓干細(xì)胞相對減少，脂肪細(xì)胞面積百分比大于對照組(P＜0.05)；模型組6w后空骨陷凹率大于對照組(P＜0.05)；模型組9w后可見骨小梁稀疏變細(xì)、結(jié)構(gòu)紊亂、

6、斷裂，骨小梁面積百分比小于對照組(P＜0.05)；電鏡下骨細(xì)胞形態(tài)發(fā)生異常改變；模型組給藥6w后骨細(xì)胞Caspase-3活性高于對照組(P＜0.05)。(2)采用組織勻漿法破碎骨組織，改良細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，丙酮沉淀法除鹽，選擇24cmPH3-10NL的固相膠條上樣，調(diào)整后的等電聚焦(IEF)程序進(jìn)行電泳，膠體考馬斯亮蘭染色法進(jìn)行凝膠染色可以得到較為理想的蛋白表達(dá)圖譜。(3)獲得分辨率和重復(fù)性較好的早期SANFH不同時(shí)間點(diǎn)及正常股

7、骨頭的蛋白表達(dá)圖譜。通過比較后發(fā)現(xiàn)24個(gè)差異蛋白點(diǎn)(差異大于2倍)，經(jīng)質(zhì)譜成功鑒定出20個(gè)，其中7種蛋白質(zhì)在早期SANFH中呈現(xiàn)表達(dá)上升，另外13種蛋白呈現(xiàn)表達(dá)下降。(4)Westernblot顯示早期SANFH中Annexin A1的表達(dá)水平低于對照組，其表達(dá)趨勢與2-DE結(jié)果相一致。
　　 結(jié)論：(1)反復(fù)大劑量注射地塞米松聯(lián)合增加股骨頭負(fù)重的方法可以誘導(dǎo)出兔早期SANFH模型。(2)建立并優(yōu)化了兔股骨頭蛋白質(zhì)2-DE技術(shù)，

8、得到了比較理想的2-DE圖譜，為進(jìn)一步開展疾病差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了良好的技術(shù)條件。(3)經(jīng)過優(yōu)化后的2-DE技術(shù)，獲得了早期SANFH不同時(shí)點(diǎn)及正常股骨頭蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜。發(fā)現(xiàn)了20種差異表達(dá)的蛋白，豐富了疾病相關(guān)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)，初步篩選出潛在的與疾病早期發(fā)病機(jī)制相關(guān)的重要蛋白質(zhì)。(4)Westernblot結(jié)果與2-DE結(jié)果相一致，驗(yàn)證了之前實(shí)驗(yàn)獲得AnnexinA1表達(dá)變化趨勢的正確性，Annexin A1可以成為進(jìn)一步研