GPR48在創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中的表達(dá)調(diào)控.pdf

1、目的:通過SD大鼠體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，探討創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中關(guān)節(jié)軟骨GPR48表達(dá)變化及其與炎癥免疫反應(yīng)因子之間的表達(dá)聯(lián)控關(guān)系，嘗試進(jìn)一步揭示創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中內(nèi)在分子機(jī)制，為創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎的研究和治療提供新思路。
　　方法:
　?。ˋ）體外實(shí)驗(yàn)：SPF級(jí)雌性4周齡SD大鼠21只，應(yīng)用頸椎脫臼法處死大鼠，醫(yī)用酒精浸泡30min，嚴(yán)格無菌條件下取軟骨組織，眼科剪剪碎組織法進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，用甲苯胺藍(lán)染色法和COL-

2、II免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行軟骨細(xì)胞鑒定。取第3代細(xì)胞隨機(jī)分為加完全培養(yǎng)基組（對(duì)照組）、LPS（濃度為20?g/mL）干預(yù)組和IL-1β（濃度為10ng/mL）干預(yù)組；三組分別在0.5h、1h、6h、24h、48h后，提取各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)GPR48、TLR4蛋白的表達(dá)，ImageJ半定量分析蛋白表達(dá)。
　　（B）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：SPF級(jí)雌性4周齡SD大鼠48只，隨機(jī)分為對(duì)照組和

3、實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組12只，實(shí)驗(yàn)組36只。實(shí)驗(yàn)組大鼠行雙側(cè)前交叉韌帶（ACL）橫斷、內(nèi)側(cè)半月板切除誘導(dǎo) PTOA，大鼠對(duì)照組膝關(guān)節(jié)打開關(guān)節(jié)囊后即逐層縫合（行假手術(shù)），兩組動(dòng)物按2w、4w、6w末分別處死并取膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，4％多聚甲醛固定2周，EDTA脫鈣2個(gè)月，石蠟包埋切片后，進(jìn)行一般染色（HE）和特殊染色（Masson、VG）觀察，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨GPR48、COL-II和TLR4蛋白的表達(dá)；光學(xué)顯微鏡下觀察并應(yīng)用IRS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

4、進(jìn)行評(píng)分。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用單因素方差分析檢驗(yàn)方法和Pea rso n相關(guān)性分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　（A）體外實(shí)驗(yàn)：
　　1.甲苯胺藍(lán)染色：正常軟骨細(xì)胞分泌特征性的酸性糖胺多糖能被甲苯胺藍(lán)染成紫紅色，軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色后呈異染性。
　　2.COL-II免疫細(xì)胞化學(xué)染色法：COL-II是軟骨細(xì)胞特異性的分泌物，因此采用COL-II免疫細(xì)胞化學(xué)

5、染色證明軟骨細(xì)胞COL-II呈陽性表達(dá)，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。
　　3.Western Blot法檢測(cè)GPR48和TLR4因子的表達(dá)：隨干預(yù)時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組（LPS和IL-1β）中GPR48表達(dá)逐漸降低（P＜0.05），對(duì)照組中GPR48表達(dá)在不同時(shí)間點(diǎn)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；TLR4在實(shí)驗(yàn)組（LPS和IL-1β組）中隨干預(yù)時(shí)間延長表達(dá)逐漸升高（P＜0.05），對(duì)照組中TLR4表達(dá)在不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

6、＞0.05）。IL-1β干預(yù)組不同時(shí)間點(diǎn)間GPR48與TLR4表達(dá)量之間呈負(fù)相關(guān)（r=－0.991，P＜0.05）；LPS干預(yù)組不同時(shí)間點(diǎn)間GPR48與TLR4表達(dá)量之間呈負(fù)相關(guān)（r=－0.997，P＜0.05）。
　?。˙）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：成功制備出SD大鼠創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。
　　1.關(guān)節(jié)軟骨HE染色：對(duì)照組膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，軟骨陷窩內(nèi)軟骨細(xì)胞排列整齊、規(guī)則，軟骨下骨小梁粗大完整。實(shí)驗(yàn)組2w膝關(guān)節(jié)面相對(duì)較好，可見軟骨陷

7、窩內(nèi)軟骨細(xì)胞排列較整齊，可見細(xì)胞簇聚，軟骨下骨小梁排列較好，骨小梁厚度增加；實(shí)驗(yàn)組4w可見軟骨表層細(xì)胞丟失，有細(xì)胞克隆出現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)比較正常，排列較紊亂，軟骨下骨小梁增多，小梁間間隙變小。實(shí)驗(yàn)組6w可見軟骨細(xì)胞丟失嚴(yán)重，細(xì)胞形態(tài)異常，且細(xì)胞排列紊亂，潮線前移，軟骨下骨小梁增多，小梁間間隙更小，且排列紊亂。
　　2.關(guān)節(jié)軟骨Masso n三色染色：結(jié)果可見軟骨基質(zhì)膠原纖維染成藍(lán)色，紅細(xì)胞及肌纖維呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。實(shí)驗(yàn)組可見軟骨

8、基質(zhì)隨時(shí)間延長而減少，基質(zhì)染色變淺，紅染區(qū)減少；對(duì)照組無明顯變化，且實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組單位面積內(nèi)膠原含量2w、4w、6w相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.關(guān)節(jié)軟骨VG染色：結(jié)果可見膠原纖維染紅色。實(shí)驗(yàn)組可見軟骨基質(zhì)隨時(shí)間延長而減少，基質(zhì)染色變淺，紅染區(qū)減少。對(duì)照組無明顯變化。且實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組單位面積內(nèi)膠原含量2w、4w、6w相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中GP

9、R48與 COL-II、TLR4：GPR48與COL-II蛋白的陽性染色呈棕黃色顆粒，均可在軟骨細(xì)胞表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)GPR48與COL-II蛋白的表達(dá)都低于對(duì)照組（P＜0.05）。TLR4蛋白的陽性染色呈棕黃色顆粒，位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，主要表達(dá)于軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞也可見少量表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn) TLR4蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)GPR48與TLR4蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=－0.925，P＜0.

10、05）。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了SD大鼠創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎模型，并在一定程度上反映出了骨性關(guān)節(jié)炎的病理變化，為后期研究建立了良好的平臺(tái)。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)表明，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在炎性因子IL-1β、LPS分別刺激下，GPR48表達(dá)下調(diào)，TLR4上調(diào)，兩者之間表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明炎性環(huán)境下，GPR48負(fù)性調(diào)控軟骨細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng)。
　　3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，隨創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎病程發(fā)展，關(guān)節(jié)軟骨GPR48表