肺癌特異性結(jié)合多肽ZS-1的靶向性鑒定和藥動學(xué)研究.pdf

1、肺癌是全球最普遍發(fā)生的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居全球惡性腫瘤之首。近年來，我國肺癌的發(fā)病率呈急劇上升趨勢，5年的生存率不足15％，其主要原因是早期診斷率不高，大多數(shù)患者被確診為肺癌時已是中晚期或出現(xiàn)了遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。目前，肺癌的治療以手術(shù)為主，聯(lián)合化療為輔。然而，以細(xì)胞毒為主的化學(xué)治療缺乏選擇性難免產(chǎn)生許多不良反應(yīng)和毒性，病人耐受性較差。因此，提高肺癌的早期診斷率和肺癌的靶向治療成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究的多肽ZS-1，是利用噬菌

2、體隨機(jī)展示肽庫對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞篩得到的多肽。對肺癌具有較高的親和力與靶向性，鑒于此，我們對ZS-1的靶向性作進(jìn)一步系統(tǒng)的鑒定并研究ZS-1的藥物動力學(xué)，為開發(fā)一種新型的肺癌靶向性藥物載體提供理論依據(jù)。
　　 本論文首先對多肽的靶向性和特異性進(jìn)行確認(rèn)。從細(xì)胞水平鑒定肺癌靶向性結(jié)合多肽，本實(shí)驗(yàn)利用了兩株人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1299和A549 進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)，并以人胚胎肺成纖維細(xì)胞系WI-38、人正常肝細(xì)胞LO-2作為

3、對照。結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC 標(biāo)記多肽[ZS-1]FITC對人肺癌細(xì)胞有較高的特異性和親和力，以人肺鱗癌細(xì)胞NCI-H1299的綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，而與人正常肝細(xì)胞和肺細(xì)胞的結(jié)合力極弱。并進(jìn)一步從組織水平鑒定該多肽的靶向性和特異性，利用共孵育，通過多次洗滌，熒光掃描結(jié)果顯示，以肺癌與對照組熒光強(qiáng)度比值大于2倍為陽性，肺癌的陽性的診斷率為37.3％，本實(shí)驗(yàn)8例對照組織中，均沒有出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，熒光強(qiáng)度均少于2倍肺對照組織。因此，假陽性的比率為0

4、％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，多肽ZS-1對人肺癌組織具有較高的特異性。在荷瘤裸鼠的動物水平，通過建立荷人肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H1299的裸鼠模型，將[ZS-1]FITC 尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，取內(nèi)臟器官并制作冰凍切片觀察其熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，多肽ZS-1在腫瘤組織處分布最多，熒光最強(qiáng)，其次，在肝和腎主要代謝器官處也有較多ZS-1分布，而在心、脾、肺、大腦和骨髓組織處分布較少，只有較弱的熒光強(qiáng)度。以上體外和體內(nèi)靶向性鑒定結(jié)果表明，ZS-1對肺癌具有

5、較高和親和力與靶向性。
　　 基于ZS-1具有較好的肺癌靶向性，然后研究ZS-1在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)以明確其在體內(nèi)的穩(wěn)定性與代謝情況，方法學(xué)考察結(jié)果顯示，血漿中不存在內(nèi)源性物質(zhì)干擾ZS-1的定量，該實(shí)驗(yàn)色譜條件下分析ZS-1具有良好的專屬性，ZS-1的保留時間是13.8 min。在0.1-50μg. mL-1范圍內(nèi)，血漿中ZS-1標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是y=19894 x-196.89，相關(guān)系數(shù)R 2=1。以信號

6、與噪音的比值等于3 定義為檢測限，該分析方法的檢測限為0.02 μg. mL-1，準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果表明，以RSD表示精密度，總體的RSD 都少于10％，日內(nèi)的RSD是1.5％-8.9％，日間的RSD是0.9％-5.4％。以相對回收率表示準(zhǔn)確度，日內(nèi)的回收率是95％-102％，日間的回收率是102％-119.5％。提取回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法學(xué)ZS-1平均提取回收率是86.1％，以上結(jié)果表明，該方法符合藥動學(xué)的分析要求。ZS-1在體外

7、血漿中穩(wěn)定性結(jié)果顯示，ZS-1在大鼠血漿中的含量隨時間增加而降低，放置5 min時，其含量是原來的91.2％，RSD是2.4％。在35 min時，回收率是12.5％，RSD是7.8％。在35 min后，其含量已在分析方法的定量限和檢測量之下。在-20℃反復(fù)凍融3次后，回收率是86.1％，RSD是2.4％，分解率為13.9％。在-20℃放置一個月后，其回收率為回收率是92.7％，RSD是8.0％，未見顯著性的分解。-80℃放置一個月后，其

8、回收率為回收率是71.3％，RSD是5.3％，分解率為28.7％。然而，ZS-1在乙腈和水混合介質(zhì)中具有良好的穩(wěn)定性，ZS-1在常溫放置6小時后、-20℃反復(fù)凍融3次、-20℃放置一個月和-80℃放置一個月后，回收率在96.8％-103.0％，均未見分解現(xiàn)象，具有較好的穩(wěn)定性。分別將ZS-1以20mg.kg-1、30mg.kg-1、45 mg.kg-1尾靜脈注射到大鼠體內(nèi)，然后分別在0.5，3，8，12，15，20，30，40、45 m

9、in 收集血漿樣品，通過反相高效液相色譜定量血漿中ZS-1含量，藥動學(xué)參數(shù)3P87 軟件計(jì)算，結(jié)果顯示，血漿中的峰濃度Cmax和藥時曲線下面積AUC 隨給藥劑量增加而增加，藥時曲線符合一級房室模型，3個劑量的半衰期沒有顯著性差異。當(dāng)給藥劑量為20mg kg-1時，藥時曲線下面積（AUC）、達(dá)峰血藥濃度（Cmax）、半衰期（T1/2）、表觀分布容積（V）、和總清除率（CL）分別是155.5±25.7 μg.min. mL-1，17.9±1

10、.0μg. mL-1，7.2±1.4 min，1117.1±20.2 mL.kg-1，143.5±28.0mL. Min-1．kg-1。
　　 當(dāng)給藥劑量為30mg.kg-1時，AUC、Cmax、T1/2、V、CL分別是307.5±57.5 μg. minmL-1，31.6±2.5 μg. mL-1，8.3±1.4 min，1187.2±150.1mL.kg-1，102.6±28.8 mLmin-1．kg-1。當(dāng)給藥劑量為45

11、mg.kg-1時，AUC、Cmax、T1/2、V、CL分別是573.3±60.2 μg. min. mL-1，47.4±3.1μg. mL-1，8.8±1.7 min，652.4±68.0mL.kg-1，75.6±8.2mL.min-1．kg-1。
　　 最后，利用反相高效液相色譜方法研究ZS-1在荷人肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H1299的裸鼠模型體內(nèi)的組織分布，各組織在0.1-50μg. mL-1范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的相關(guān)性，各組

12、織的提取回收率在60.4％-85.1％，RSD是2.3％-7.7％。當(dāng)給藥劑量為30mg.kg-1尾靜脈注射到荷瘤裸鼠體內(nèi)，分別在5，10，15，20，25 min后，乙醚麻醉裸鼠，把肝、腎、脾、腦、肺、心和腫瘤組織取出并勻漿，在酸性條件下提取多肽ZS-1，通過HPLC 測定ZS-1的含量，結(jié)果顯示，在5 min時，除大腦組織外，都可見ZS-1的分布，ZS-1主要分布在心、肝、和腎組織。在10min時，肺組織不見ZS-1的分布，腫瘤組織

13、ZS-1的濃度是11.3±0.31μg. mL-1這時，腫瘤組織中ZS-1的含量最高。在15 min時，ZS-1只分布在腫瘤、肝、腎、組織，其濃度分別為4.2±0.27 μg. mL-1、1.6±0.15 μg. mL-1、3.5±0.17 μg. mL-1。
　　 此時，腫瘤組織中ZS-1的含量仍然是最高。當(dāng)?shù)搅?0min時，ZS-1只分布在腫瘤和腎組織，其濃度分別為1.3±0.05 μg. mL-1、0.9±0.05 μg.