利用噬菌體肽庫篩選肺癌NCIH1299細胞特異性多肽ZP1及其配體periplakin的研究.pdf

1、背景： 抗體技術(shù)已經(jīng)由細胞工程抗體發(fā)展到了基因工程抗體。噬菌體抗體、多肽庫、肽庫技術(shù)的出現(xiàn)及噬菌體抗體、多肽的研制成功已成為抗體研究領(lǐng)域的突破性進展之一，該技術(shù)被譽為抗體技術(shù)的第三次革命。 噬菌體抗體、多肽庫（phage antibody library）技術(shù)是通過PCR方法將全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因克隆出來，克隆至噬菌粒載體上，抗體片段與噬菌體的外殼蛋白以融合蛋白的形式表達在噬菌體的表面。噬菌體展示技術(shù)建立隨機肽庫

2、的方法是：通過化學合成的方法，隨機合成特定長度肽的寡核苷酸片段，然后通過基因工程重組技術(shù)插入至噬菌體載體的外殼蛋白編碼基因中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，增殖和產(chǎn)生的噬菌體其表面攜帶有外源多肽，每個噬菌體表面表達一種外源肽，所有這些噬菌體構(gòu)成隨機肽庫。利用目標分子從整個噬菌體隨機肽庫中經(jīng)篩選—擴增—篩選等步驟，最后獲得能與靶分子高親和力結(jié)合的噬菌體克隆。通過測定該噬菌體的DNA序列后，就可知道噬菌體所攜帶的多肽氨基酸序列。 噬菌體抗體、肽庫技

3、術(shù)由兩大核心內(nèi)容組成：①利用絲狀噬菌體或噬菌粒作為表達載體，通過基因工程重組技術(shù)將外源隨機合成的DNA片段插入噬菌體外殼蛋白編碼基因中，并在噬菌體表面展示該外源DNA所編碼的多肽；②利用目標靶分子如抗體、受體蛋白等，在噬菌體隨機肽庫中與展示在噬菌體表面的多肽發(fā)生特異性結(jié)合，再通過有效的親和淘選方法，篩選出高親和力結(jié)合多肽的表達噬菌體。因為在噬菌體表面表達的抗體、多肽片段具有與抗原結(jié)合的生物學活性，因此，可以用親和層析的方法從噬菌體抗體、

4、多肽庫中篩選出目的噬菌體抗體、多肽，并可獲得特異性噬菌體抗體、多肽的基因。獲得目的噬菌體可感染合適的大腸桿菌進行分泌型表達，再采用蛋白質(zhì)L—瓊脂糖通過親和層析方法純化出具有與抗原結(jié)合活性的單鏈抗體。這一技術(shù)將抗體的表型和基因型聯(lián)系起來，因而使識別抗原的能力與進行再擴增的能力結(jié)合在一起，模擬生物體內(nèi)B淋巴細胞的有關(guān)特性——識別與擴增的統(tǒng)一，因而是一種極為高效的表達和篩選抗體的體系。 噬菌體抗體、多肽庫技術(shù)是以基因工程技術(shù)來生產(chǎn)抗體

5、，它的出現(xiàn)使傳統(tǒng)的以細胞工程技術(shù)制備單克隆抗體的方法完全改觀，與雜交瘤技術(shù)相比它具有以下的優(yōu)點：（1）方法簡單、快速：從淋巴細胞中提取mRNA到構(gòu)建抗體庫，繼而篩選出目的噬菌體抗體、多肽，整個過程一般只需要幾周的時間，而雜交瘤技術(shù)從脾細胞融合到獲得穩(wěn)定的單克隆抗體細胞株至少需數(shù)月。（2）不需要實驗動物或大量的細胞培養(yǎng)就可生產(chǎn)抗體。（3）可以繞過免疫制備抗體：由于人淋巴細胞庫中天然存在針對各種抗原的特異性細胞，可以直接利用人外周血淋巴細胞

6、構(gòu)建“天然抗體庫”，篩選出目的噬菌體抗體、多肽，使制備全人抗體成為可能，尤其是制備自身抗原和其他弱免疫原性抗原的抗體具有獨到的優(yōu)勢。（4）可以對抗體基因進行改造，在體外通過基因突變、鏈更替等技術(shù)，可進一步提高抗體的親和力和穩(wěn)定性。（5）可以制備多克隆抗體：對抗體庫進行篩庫時，最初得到的是多克隆重組噬菌體抗體、多肽。將該多克隆抗體用于診斷可提高敏感度，用于治療可提高療效，也是分子識別、抗原表位研究的理想工具。（6）可大規(guī)模生產(chǎn)，成本低：抗

7、體片段可在大腸桿菌中進行分泌型表達，易于分離純化出有生物學活性的抗體分子，通過發(fā)酵大量生產(chǎn)。克服了雜交瘤細胞通過單克隆抗體腹水或大規(guī)模細胞培養(yǎng)來制備抗體的局限性。（7）噬菌體抗體、多肽的保存和傳代穩(wěn)定，而雜交瘤細胞株在傳代過程中則有明顯的不穩(wěn)定性。 噬菌體肽庫技術(shù)實際上是通過噬菌體展示技術(shù)將一定長度的所有外源多肽展示于噬菌體載體表面，實現(xiàn)基因表達產(chǎn)物與親和篩選相結(jié)合的一種技術(shù)。以噬菌體為載體，把一段特定長度、隨機合成的基因片段定

8、向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)（如pⅢ和pⅧ）N端的編碼基因中，使這段基因編碼的相應(yīng)外源多肽在噬菌體外殼蛋白的N端以融合蛋白的方式表達并展示于噬菌體顆粒的表面，而且這種插入的外源多肽不影響和干擾噬菌體的生活周期，同時能夠保持其天然構(gòu)象，可以被相應(yīng)的抗體或受體等靶分子所識別。同時，由于這段特定長度的基因是隨機合成的，從理論上講這段基因所編碼的相應(yīng)多肽應(yīng)該包含自然界中這個長度肽的所有序列，這樣就構(gòu)成了一個特定長度的多肽庫，而且?guī)烊萘繕O大。進而可以利

9、用靶分子，通過適當?shù)挠H和富集即生物淘選（biopanning）方法即“親和吸附—洗脫—回收—擴增”多輪親和篩選富集過程，洗去未吸附的或非特異結(jié)合的噬菌體，就可以從這個肽庫中篩選到與靶分子特異性結(jié)合、表達有目的肽的噬菌體，經(jīng)過感染大腸桿菌后可以大量擴增。另外，外源多肽展示在噬菌體的表面，但其編碼基因位于病毒單鏈基因中，可通過對噬菌體的DNA測序推導出來，因此這種方式將多肽的表型與基因型密切聯(lián)系在一起，實現(xiàn)了表型和基因型的轉(zhuǎn)換。 近

10、年來，隨著噬菌體抗體、多肽庫、肽庫技術(shù)的不斷發(fā)展，人們正在廣泛應(yīng)用該技術(shù)研制備種抗體片段。其中，因單鏈抗體具有許多優(yōu)點而成為噬菌體抗體、多肽研究的熱點。單鏈抗體（Single chain variable fragment，ScFv）是由抗體輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)通過一接頭（Linker）連接而組成的，是目前報道最多的一類小分子抗體片段，其分子量僅為完整抗體分子的六分之一，而且還有容易進入病灶組織的周圍循環(huán)及在腎內(nèi)清除快等優(yōu)點，在疾病的

11、診斷和治療方面已引起廣泛重視。此外，由于單鏈抗體缺少抗體Fc段，只識別靶抗原，不與具有Fc受體的非靶細胞結(jié)合，因此在體內(nèi)定位診斷時背景低、圖像清晰，在某些疾病的體內(nèi)定位診斷方面也具有無可比擬的優(yōu)點以及巨大的潛在價值。 肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是致死率最高的惡性腫瘤。歐洲每年新診斷的病例超過20萬，約占所有腫瘤死亡人數(shù)的20％，男性死亡人數(shù)的28％。目前肺癌的主要治療手段是外科手術(shù)，進展期肺癌手術(shù)后5年生存率不到10％。肺癌

12、總生存率在過去的20年中無明顯提高，約14％。而在過去的30年中，乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等生存率大大提高了，其中一個重要原因是早期診斷。因此，要提高肺癌患者的生存率，早期診斷尤其重要。 目的： 1、通過噬菌體抗體、肽庫技術(shù)，以肺癌NCI H1299為抗原篩選并鑒定非小細胞肺癌特異性結(jié)合多肽。 2、進一步利用篩選到的特異性多肽尋找新的非小細胞肺癌腫瘤標志物。 方法： 1、以肺癌細胞株NCIH129

13、9為抗原，從商業(yè)公司購買經(jīng)過鑒別的噬菌體12多肽庫。 2、將肺癌細胞貼壁培養(yǎng)，利用親和吸附原理，將噬菌體肽庫經(jīng)過4輪的吸附—洗滌—洗脫—富集的淘洗過程，經(jīng)ELISA方法從富集的噬菌體多肽中篩選出特異性的抗肺癌細胞的噬菌體多肽。 3、將篩選出的結(jié)合肺癌的噬菌體多肽克隆，提取、純化噬菌體質(zhì)粒，DNA測序，合成多肽，標記熒光素，以ELISA和免疫組織化學方法對肺癌細胞和MRC—5正常肺細胞進行初步特異性結(jié)合鑒定。 4、

14、肺癌特異性結(jié)合多肽競爭性抑制試驗，將為標記的合成多肽與噬菌體競爭抑制，計算噬菌體克隆，確定其特異性。 5、以特異性結(jié)合多肽為探針篩選人肺癌cDNA文庫，“釣取”肺癌特異性抗原——肺癌腫瘤新標志物。 結(jié)果： 1、以肺癌NCI H1299為抗原，從構(gòu)建好的噬菌體多肽庫進行4輪“吸附—洗滌—洗脫—擴增”的淘洗，挑選出9個經(jīng)ELISA方法鑒定的特異性肺癌結(jié)合陽性的噬菌體多肽克隆。 2、全部提取噬菌體質(zhì)粒、測序，結(jié)

15、果表明，我們獲得了9個特異性結(jié)合多肽，并且其中一個多肽的親和力最高（ZP1），其氨基酸序列為HNKHLPSTQPLA（已經(jīng)申請專利、受理中），通過化學方法合成該多肽，其中一部分標記熒光素FITC。 3、利用熒光標記多肽，經(jīng)細胞熒光和免疫化學證實，ZP1的特異性和親和力較高，為肺癌特異性最強結(jié)合多肽。 4、ZP1多肽與含ZP1多肽的噬菌體競爭性抑制試驗，表明ZP1具有較強的親和力和特異性，這說明我們篩選到的ZP1是特異性地

16、結(jié)合在肺癌細胞上的。 5、以特異性結(jié)合多肽ZP1標記熒光素FITC為探針篩選人肺癌cDNA文庫，“釣取”肺癌特異性抗原——肺癌腫瘤新標志物，我們成功獲得了細胞膜蛋白——periplakin。 結(jié)論： 1、以NCI H1299為抗原，從噬菌體12多肽庫中成功篩選出結(jié)合肺癌特異性抗原的特異性噬菌體克隆9個，并成功地鑒別其結(jié)合肺癌抗原的特異性。 2、發(fā)現(xiàn)了ZP1序列為一全新的多肽，利用體內(nèi)外特異性噬菌體克隆（含