利用噬菌體展示淘選特異性結(jié)合sHB-EGF的活性多肽.pdf

1、肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子（Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor, HB-EGF）能結(jié)合肝素，是表皮生長(zhǎng)因子家族中的一員，與表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合后，以旁分泌、自分泌、近分泌的形式發(fā)揮其生物活性。HB-EGF在很多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，例如傷口愈合、胚胎植入、動(dòng)脈粥樣硬化和心臟發(fā)育等。臨床實(shí)驗(yàn)證明HB-EGF在乳腺癌和卵巢癌中過(guò)量表達(dá)，特異性抑制HB-EG

2、F及其下游信號(hào)通路后，腫瘤細(xì)胞的凋亡數(shù)增加，生長(zhǎng)速度變慢，血管生成受到抑制，遷移侵潤(rùn)速率變慢；且拮抗HB-EGF和抗癌藥物聯(lián)合用藥時(shí)，腫瘤的抗藥性大大降低，說(shuō)明HB-EGF與乳腺癌和卵巢癌等腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和抗藥性有密切的關(guān)系。所以，開(kāi)發(fā)特異性抑制HB-EGF的藥物可能會(huì)抑制相應(yīng)癌癥的發(fā)生發(fā)展。
　　通過(guò)在噬菌體外殼蛋白基因中插入序列隨機(jī)的外源多肽編碼序列，多肽以融合蛋白的形式被展示在病毒的表面，這樣就使得病毒內(nèi)編碼外源多肽的基因

3、序列與病毒表面的多肽建立了直接聯(lián)系。體外噬菌體展示的流程是先將肽庫(kù)與固定的靶分子結(jié)合，洗去未結(jié)合的噬菌體，繼而將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)并通過(guò)轉(zhuǎn)染宿主菌進(jìn)行擴(kuò)增。三到五輪淘選之后，即可富集到與靶分子具有高親和力的噬菌體。多肽的DNA序列可以通過(guò)測(cè)序得知。
　　多肽藥物具有免疫原性低、分子量小和易吸收等優(yōu)點(diǎn)，所以本課題旨在通過(guò)噬菌體展示技術(shù)淘選到能特異性結(jié)合HB-EGF并能抑制其活性的多肽，從而為研發(fā)抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。
　

4、　本課題首先利用PCR獲得sHB-EGF基因，經(jīng)雙酶切將目的基因?qū)朐吮磉_(dá)載體pET-30a后，重組載體被轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主菌 BL21(DE3)，細(xì)菌經(jīng) IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)出sHB-EGF。經(jīng)鎳柱親和層析和肝素親和層析純化后我們得到大量純蛋白(His)6-sHB-EGF。為避免后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，我們用腸激酶去掉占全長(zhǎng)重組蛋白53％的(His)6標(biāo)簽，得到sHB-EGF蛋白。
　　我們以 sHB-EGF為靶分子，按照結(jié)合

5、-清洗-洗脫的流程進(jìn)行了兩次體外噬菌體展示：分別用肝素鈉和 sHB-EGF配制洗脫液進(jìn)行淘選，并最終獲得了三個(gè)候選多肽——TUZG1、2和3。后經(jīng)ELISA實(shí)驗(yàn)證明：TUZG1、2和3都與sHB-EGF特異性結(jié)合。
　　細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，sHB-EGF具有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3遷移和侵潤(rùn)的作用。通過(guò)多肽生物學(xué)效應(yīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)：候選多肽TUZG3能顯著抑制sHB-EGF的促遷移和促侵潤(rùn)作用，而TUZ

6、G1和TUZG2對(duì)sHB-EGF的促遷移和促侵潤(rùn)作用沒(méi)有顯著影響。由于 TUZG1和 TUZG2是肝素鈉洗脫下來(lái)的多肽，我們因此推測(cè)其可能具有與肝素類(lèi)似的抗凝血作用。經(jīng) APTT、試管法、剪尾法驗(yàn)證 TUZG2確實(shí)具有與肝素類(lèi)似的抗凝血活性。
　　綜上所述，我們通過(guò)分子克隆、原核表達(dá)、親和層析等方法，獲得了高純度靶分子sHB-EGF；利用噬菌體展示獲得了特異性結(jié)合 sHB-EGF的三條候選多肽；最后經(jīng)生物學(xué)效應(yīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，TUZG3